用于纯化和扩增核酸的系统和方法技术方案

提供了用于生物样品中核酸的纯化、或检测、或扩增、或定量的组合物、方法、系统和试剂盒。在一些实施方案中，提供单一即时护理装置/反应器。

Systems and methods for purification and amplification of nucleic acids

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化和扩增核酸的系统和方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年2月27日提交的名称为“用于纯化和扩增核酸的系统和方法(SYSTEMANDMETHODFORPURIFYINGANDAMPLIFYINGNUCLEICACIDS)”的美国临时申请号62/464,097和2017年9月6日提交的名称为“用于纯化和扩增核酸的系统和方法(SYSTEMANDMETHODFORPURIFYINGANDAMPLIFYINGNUCLEICACIDS)”的美国临时申请号62/554,870的优先权，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
本披露总体上涉及通过聚合酶链式反应(PCR)进行核酸纯化和扩增。更特别地，本披露涉及用于在即时护理(pointofcare)系统或装置中进行核酸纯化和扩增的组合物、系统和方法。
技术介绍
即时护理诊断系统和方法为医疗专业人员提供及时的诊断信息，而无需使用更昂贵和耗时的基于实验室的试验。典型的即时护理检测在患者-提供者联系处(在临床医生办公室或诊所)、在现场医疗所或现场试验、提供者家访或类似情况下进行。正因如此，许多有价值的诊断试验被认为对于即时护理诊断而言是不切实际的。例如，许多核酸扩增试验鉴定特定的疾病载体核酸以准确诊断感染及其原因，但其对于即时护理诊断不可行。为了从生物样本中扩增核酸，需要纯化核酸以去除消化酶、抑制剂分子和样本中存在的会抑制核酸扩增反应(例如RT-qPCR和PCR反应)的其他污染物。另外，这些试验对环境污染(医疗设施内部或外部的许多即时护理场景中的问题)极为敏感。简而言之，现有的核酸纯化和扩增方法耗时，可能使用相对大量的试剂，需要分离或离心步骤，或使用需要耗时回收和再循环的昂贵的微珠或类似基片。因此，提供可用于即时护理装置的分离、扩增和定性和/或定量分析核酸的装置、组合物和方法将是有益的。本披露与此需求相关。
技术实现思路
本领域需要可以用少量试剂和不使用珠子或离心来实施的核酸提取、纯化和分析的方法和系统。本批露通过提供在微流体环境中纯化核酸以解决前述问题。尽管使用基于二氧化硅的色谱法进行核酸纯化的现有实验室方法需要试剂和方法(所述试剂和方法不适合用于基于芯片的独立诊断装置)，但本批露旨在于在与随后定量测定相同的装置上促进核酸的提取、分离、扩增和分析。在一方面，本披露提供了用于从生物样品中纯化核酸的方法，该方法包括以下步骤：将未纯化的核酸递送到微流体区域中，使所述核酸与微流体区域中固定的表面接触，其中所述核酸附着于所述表面；用第一缓冲液洗涤所述微流体区域和表面；用第二缓冲液洗涤所述微流体区域和表面，其中所述第二缓冲液具有等于或高于所述第一缓冲液的pH。在一方面，所述固定的表面包含二氧化硅或金属氧化物或氮化物。在一方面，所述金属氧化物包括氧化铝或氧化铪。在一方面，本披露还提供扩增所述核酸中的至少一些以产生扩增产物；和检测扩增产物。在一方面，将所述核酸递送至所述微流体区域包括将生物样品添加至附着缓冲液，破坏附着缓冲液中的细胞、病毒或细菌以使所述核酸与所述附着缓冲液混合。破坏可包括细胞/病毒裂解。可以使用任何合适的方法进行裂解，所述方法包括但不必限于基于热、化学和机械的裂解。在一方面，本披露提供了样品中某一核酸的纯化、扩增和检测其存在或不存在的方法。在实施方案中，本披露提供核酸扩增产物的产生和分析，包括以下步骤：将未纯化的核酸递送到微流体区域中，使所述核酸与微流体区域中固定的表面接触，其中所述核酸附着于所述表面；用第一缓冲液洗涤所述微流体区域和表面；用第二缓冲液洗涤所述微流体区域和表面，其中在某些方法中所述第二缓冲液具有等于或高于所述第一缓冲液的pH；扩增所述核酸中的至少一些以产生扩增产物；和检测一个或多个所述扩增产物。在一方面，将所述核酸递送至所述微流体区域包括，获得已知或怀疑包含或可能包含核酸的生物样品、将所述样品添加至附着缓冲液、和裂解或以其他方式破坏所述附着缓冲液中的细胞和/或病毒使所述病毒或细胞内容物与所述附着缓冲液混合。在一方面，将所述核酸递送至所述微流体区域的步骤使用包含亲液盐(kosmotropicsalt)和核酸酶抑制剂的附着溶液。在实施方案中，本披露的实施方案中使用的一种或多种溶液(包括但不限于缓冲液)不含有机溶剂。在实施方案中，所述溶液不含乙醇、不含离液盐(chaotropicsalt)，或者不含有机溶剂和离液盐。本领域技术人员将认识到，然而在某些情况下，鉴于本披露的益处，术语“不含(free)”可以包含对本领域技术人员显而易见的痕量的离液盐、或有机溶剂(其包括但不必限于乙醇或其他醇)。在本披露的一方面，所述纯化和扩增步骤在同一装置中或在同一装置上进行。在一方面，纯化、扩增和检测全部发生在同一装置中。在一方面，在检测扩增产物之后，该方法包括确定所述核酸来源的身份，和将该结果报告给诊断提供者、在计算机可读介质中创建该结果的记录，或两者均有。附图说明附图提供了视觉表示，其将用于更全面地描述在此公开的代表性实施方案，并且可以由本领域普通技术人员用来更好地理解它们及其固有优点。图1A)SuperscriptIII-TfiRT-qPCR性能试验的扩增曲线和B)SuperscriptIII-TfiRT-qPCR性能试验的标准曲线。图2A)SuperscriptIII-AmpTaq360RT-qPCR性能试验的扩增曲线和B)SuperscriptIII-AmpTaq360RT-qPCR性能试验的标准曲线。图3使用HfO2涂覆的表面(使用覆盖晶片(blanketwafer)作为非限制性说明)，在不同结合pH、洗脱pH和洗脱温度下从缓冲液中对丙型肝炎病毒(HCV)RNA的提取。图4使用HfO2涂覆的表面从血浆中提取RNA期间，洗涤缓冲液中KH2PO4浓度的滴定。图5使用HfO2涂覆的表面对来自15种不同的血浆样本的RNA的提取。图6使用Al2O3涂覆的表面，在不同结合pH、洗脱pH和洗脱温度下从缓冲液中对RNA的提取。图7使用Al2O3涂覆的表面从血浆中提取RNA期间，洗涤缓冲液中NaOAc浓度的滴定。图8使用Al2O3涂覆的反应器从15种不同的血浆样本中提取RNA的结果。图9使用具有柱结构的反应表面提取RNA的结果。图10(A)通过在刮下的柱表面上从缓冲液中提取和纯化RNA而获得的循环阈值(Cyclethreshold，Ct)的数据。(B)RNA回收结果。图11使用具有不同pH值的结合缓冲液获得的RNA回收结果。图12使用加热的血浆和不同的盐获得的RNA回收结果。图13使用未加热的血浆(具有蛋白酶)获得的RNA回收结果。图14描绘了表示通过毛细管流动提取RNA的数据。图15显示从细胞培养物中获得并与刮下的柱在不同十二烷基硫酸钠(SDS)浓度(A)和温度(55℃(B)和75℃(C))下温育的病毒颗粒的裂解的数据。图16表示使用内部对照RNA和HCVRNA的荧光归一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纯化和检测核酸扩增产物的方法，所述方法包括/na.将具有未纯化的核酸的样品递送到微流体区域；/nb.使所述核酸与所述微流体区域中的固定的表面接触，其中所述核酸附着于所述表面；/nc.用第一缓冲液洗涤所述微流体区域和表面；/nd.用第二缓冲液洗涤所述微流体区域和表面，其中所述第二缓冲液具有等于或高于所述第一缓冲液的pH；/ne.扩增所述核酸中的至少一些以产生扩增产物；和/nf.检测所述扩增产物；/n其中将所述核酸递送至所述微流体区域的步骤使用包含亲液盐和任选的核酸酶抑制剂的附着溶液，并且其中所述附着溶液不含离液盐和乙醇。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170227 US 62/464,097;20170906 US 62/554,8701.一种纯化和检测核酸扩增产物的方法，所述方法包括
a.将具有未纯化的核酸的样品递送到微流体区域；
b.使所述核酸与所述微流体区域中的固定的表面接触，其中所述核酸附着于所述表面；
c.用第一缓冲液洗涤所述微流体区域和表面；
d.用第二缓冲液洗涤所述微流体区域和表面，其中所述第二缓冲液具有等于或高于所述第一缓冲液的pH；
e.扩增所述核酸中的至少一些以产生扩增产物；和
f.检测所述扩增产物；
其中将所述核酸递送至所述微流体区域的步骤使用包含亲液盐和任选的核酸酶抑制剂的附着溶液，并且其中所述附着溶液不含离液盐和乙醇。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一缓冲液还包含NaCl并且具有1至4.5的pH。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二缓冲液具有1至4.5的pH，并且不含有亲液盐。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是生物样品，所述方法还包括裂解所述生物样品中的病毒和/或细胞以将未纯化的核酸释放到溶液中，作为将所述核酸递送到微流体区域中的步骤的一部分。


5.根据权利要求1所述的方法，其中使所述核酸与所述微流体区域中的固定的表面接触的步骤包括在20℃-80℃之间的温度下在所述微流体区域中对核酸进行温育。


6.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定的表面包含金属氧化物或金属氮化物或氧化硅或氮化硅。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述金属氧化物是氧化铝(Al2O3)或氧化铪(HfO2)。


8.根据权利要求4所述的方法，其中裂解所述生物样品中的病毒和/或细胞的步骤包括：通过加热所述附着缓冲液中的所述生物样品、或者通过将所述附着缓冲液中的所述生物样品暴露于化学组合物使得发生裂解来释放核酸，其中所述化学组合物任选地包含0.1％-1.0％SDS和/或0.1％-0.5％NP-40洗涤剂。


9.根据权利要求8所述的方法，其中在所述微流体区域中的附着缓冲液中加热所述生物样品。


10.一种用于微流体扩增测定的亲液溶液，其中所述亲液盐是KH2PO4、或(NH4)2SO4、K2SO4，所述溶液任选地包含1％-35％DMSO。


11.一种使用权利要求1所述的方法纯化和扩增核酸序列的系统，所述系统包括：微流体反应器，所述微流体反应器具有至少一个具有金属氧化物涂层或氧化硅(SiO2)涂层或氮化硅涂层的固定的表面，所述涂层基本上由氧化铝(Al2O3)、氧化铪(HfO2)、氮化硅(Si3N4)或氧化硅(SiO2)组成。


12.根据权利要求11所述的系统，其中所述至少一个表面存在于所述微流体反应器中的多个微柱上。


13.根据权利要求12所述的系统，其中所述多个微柱具有以下特征中的至少一个：i)约190μm-200μm的微柱高度；ii)约20μm的微柱宽度；约50μm的中心至中心的微柱距离；iii)约30μm的柱间距离。


14.根据权利要求13所述的系统，其中所述多个微柱中的至少一些与多核苷酸非共价缔合。


15.一种测定核酸的方法，所述方法包括
a.使包含或疑似包含核酸的生物样品与表面接触，其中所述核酸如果存在的话附着于所述表面；
b.用第一缓冲液洗涤附着的核酸和所述表面；
c.用第二缓冲液洗涤附着的核酸和所述表面，其中所述第二缓冲液具有等于或高于所述第一缓冲液的pH；
d.扩增所述核酸中的至少一些以产生扩增产物；和
e.检测所述扩增产物；
其中使用包含亲液盐和任...

【专利技术属性】
技术研发人员：威廉·奥斯本，马顿·福尔瓦特，丽塔·沃斯，罗德里戈·韦德凯尔，
申请(专利权)人：医学诊断公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE