猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的分子标记与应用制造技术

本发明专利技术提供了猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的分子标记，所述的分子标记位于猪SPATA6基因第十内含子的部分DNA序列中，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记包括：rs341061477位点的SNP：在所述序列的第70bp处存在一个C/T的等位基因突变；以及rs331255092位点的SNP：在第76bp处存在一个A/T的等位基因突变；本发明专利技术还提供了猪SPATA6基因精液品质性状相关SNP的检测试剂盒，包括：如SEQ ID NO.2～3所示的引物对；如SEQ ID NO.4～5所示的SNaPshot单碱基延伸引物。为猪精液品质性状的分子标记辅助育种提供了两个新的分子育种标记。

Molecular markers related to semen quality in intron 10 of Spata6 gene and their application

The invention provides a molecular marker related to pig semen quality character in intron 10 of pig Spata6 gene, the molecular marker is located in part of DNA sequence of intron 10 of pig Spata6 gene, the nucleotide sequence of the molecular marker is shown in SEQ ID No.1, the molecular marker includes: SNP at rs341061477 site: there is a C / T allele at 70bp of the sequence Because of mutation; and SNP at rs331255092: there is an A / T allele mutation at 76bp; the invention also provides a detection kit for SNP related to semen quality traits of pig Spata6 gene, including: primer pair as shown in SEQ ID No.2-3; single base extension primer as shown in SEQ ID no.4-5. Two new molecular breeding markers were provided for marker assisted breeding of semen quality traits.

【技术实现步骤摘要】
猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的分子标记与应用
本专利技术涉及猪分子标记筛选
，尤其涉及猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的分子标记与应用。
技术介绍
公猪的繁殖力在猪生产中发挥重要的作用，一般通过鉴定精液的品质来衡量公猪的繁殖性能。精液品质的指标包括精液量、精子密度、精子形态及精子活力等。遗传作用和环境作用是影响精液品质的两个重要因素，环境因素可以进行人为的控制和改善，但只有提高遗传效率才能从根本上提高精液品质，提高公猪的繁殖力。由于公猪繁殖性状的遗传力低，导致常规选择进展缓慢。随着分子生物学技术的兴起和迅速发展，发展了常规育种与标记辅助选择(MAS)相结合的方法，可以有效地加快公猪精液品质性状的选择进展。SPATA6蛋白是一个精子发生相关蛋白，在脊椎动物中高度保守，特异表达在精子细胞和成熟精子中(Ohetal.2003)，且SPATA6基因在大白猪性成熟前后的睾丸组织中差异表达(Songetal.2015)。有研究表明SPATA6基因在睾丸生殖细胞肿瘤形成与睾丸的发育中起重要作用(Huoetal.2015)。SPATA6基因对于精子躯干中段组装和精子头尾紧密连接起着至关重要作用，SPATA6基因失活造成无头精子症并导致小鼠不育(Yuanetal.2015)。综上所述，SPATA6基因参与调控精子发生过程。对猪精液品质性状的SNPs的表征对于通过猪精液品质性状标记辅助选择具有十分重要的作用。但经检索，但目前未见已鉴定的关于SPATA6基因影响精液品质的分子标记。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的分子标记与应用，本专利技术发掘了猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的分子标记，为猪精液品质性状的分子标记辅助育种提供了两个新的分子育种标记。本专利技术的目的之一在于提供一种猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的分子标记，所述的分子标记位于猪SPATA6基因第十内含子的部分DNA序列中，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，该序列长度为503bp；所述分子标记包括：rs341061477位点的SNP：在所述序列的第70bp处存在一个C/T的等位基因突变；以及rs331255092位点的SNP：在第76bp处存在一个A/T的等位基因突变。本专利技术的目的之二在于提供所述的分子标记在猪精液品质性状标记辅助选择中的应用。本专利技术的目的之三在于提供一种猪SPATA6基因精液品质性状相关SNP的检测试剂盒，包括：用于扩增所述SEQIDNO.1所示序列的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；以及2个SNaPshot单碱基延伸引物：用于检测rs341061477位点的延伸引物如SEQIDNO.4所示，和用于检测rs331255092位点的延伸引物如SEQIDNO.5所示。本专利技术的目的之四在于提供使用所述检测试剂盒检测猪SPATA6基因精液品质性状相关SNP的方法，包括以下步骤：步骤1、以从待测样本中提取的基因组DNA为模板，通过选自所述SEQIDNO.2～3所示PCR引物对构建多重PCR扩增体系进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化处理；步骤2、以所述纯化的PCR产物为模版，通过选自所述SEQIDNO.4～5所示SNaPshot单碱基延伸引物构建SNaPshot反应体系进行单碱基延伸反应，并对反应制备的单碱基延伸产物进行纯化处理；步骤3、使用遗传学分析仪检测所述纯化后的单碱基延伸产物，并使用基因分析软件对结果进行分析。本专利技术的目的之五在于提供所述的检测试剂盒在猪精液品质性状标记辅助选择中的应用。本专利技术人从猪精液中提取基因组DNA。登录NCBI数据库中下载猪SPATA6基因的DNA序列设计特异引物(该引物的序列如序列表SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示)。分别以杜洛克猪和大白猪的DNA为模板进行PCR扩增(如图2所示)，得到如序列表SEQIDNO.1所示的基因片段。对PCR产物回收并通过SNaPshot技术进行检测，SNaPshotPCR的rs341061477和rs331255092位点的延伸引物序列如序列表SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示；根据测序结果筛查DNA序列变异，在第70bp处存在一个C/T的等位基因突变，以及在第76bp处存在一个A/T的等位基因突变(如图1所示)。并分别在杜洛克猪和大白猪中进行其基因型与精液品质性状的关联分析。本专利技术的有益效果：本专利技术发掘了猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的分子标记(rs341061477和rs331255092位点)，所述的分子标记位于猪SPATA6基因第十内含子的部分DNA序列中，该单核苷酸多态性(SNP)可以作为猪精液品质性状的分子标记，本专利技术为猪精液品质性状的分子标记辅助育种提供了两个新的遗传标记。附图说明图1是本专利技术中猪SPATA6基因rs341061477和rs331255092位点的GeneMapperV4.0软件读取结果图；A图：rs341061477位点的CC基因型；B图：rs341061477位点的CT基因型；C图：rs341061477位点的TT基因型；D图：rs331255092位点的AA基因型；E图：rs331255092位点的AT基因型；F图：rs331255092位点的TT基因型；图2是猪SPATA6基因序列片段琼脂糖凝胶电泳图谱。具体实施方式实施例1猪SPATA6基因片段的获得及多态性检测方法的建立1、猪基因组DNA的提取本专利技术的试验猪品种为杜洛克猪和大白猪，样本来源于华中农业大学。猪基因组DNA的提取采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：(1)吸取100μL精子沉淀；加入400μLddH2O、100μL5*精子提取液、10μL蛋白酶K(20mg/mL)充分混匀，55℃水浴直至充分消化至透明。(2)加入200μL结合液CB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。(3)冷却后加入100μL异丙醇，剧烈颠倒充分混匀。(4)用1mL的枪头吸取上述混合物，加入吸附柱AC中，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。(5)加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。(6)加入700μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，倒掉废液。(7)重复操作步骤6。(8)将吸附柱AC放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，以免残留的乙醇抑制下游反应。(9)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的分子标记，其特征在于，所述的分子标记位于猪SPATA6基因第十内含子的部分DNA序列中，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该序列长度为503bp；所述分子标记包括：rs341061477位点的SNP：在所述序列的第70bp处存在一个C/T的等位基因突变；以及rs331255092位点的SNP：在第76bp处存在一个A/T的等位基因突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪SPATA6基因第十内含子内与猪精液品质性状相关的分子标记，其特征在于，所述的分子标记位于猪SPATA6基因第十内含子的部分DNA序列中，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，该序列长度为503bp；所述分子标记包括：rs341061477位点的SNP：在所述序列的第70bp处存在一个C/T的等位基因突变；以及rs331255092位点的SNP：在第76bp处存在一个A/T的等位基因突变。


2.如权利要求1所示的分子标记，其特征在于，所述序列的第70bp处的C或T的碱基多态性位点，表现为CC、CT或TT三种基因型，其中C是优势等位基因。


3.如权利要求1所示的分子标记，其特征在于，所述序列的第76bp处的A或T的碱基多态性位点，表现为AA、AT或TT三种基因型，其中A是优势等位基因。


4.权利要求1-3任一所述的分子标记在猪精液品质性状标记辅助选择中的应用。


5.一种猪SPATA6基因精液品质性状相关SNP的检测试剂盒，其特征在于，包括：
用于扩增所述SEQIDNO.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：周佳伟，梅书棋，彭先文，吴俊静，乔木，宋惠彬，李凤娥，武华玉，刘贵生，孙华，宋忠旭，李良华，赵海忠，董斌科，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42