利用线粒体DNA控制区进行黄鲫遗传学分析的方法技术

本发明专利技术提供一种利用线粒体DNA控制区进行黄鲫遗传学分析的方法，属于基因工程技术领域，包括如下步骤：在黄鲫肌肉组织样本中加入裂解液进行裂解，然后分离上清液，获得线粒体基因组DNA；将线粒体基因组DNA进行靶序列的筛查；从筛查结果进行黄鲫遗传学分析；其中，裂解液为包含NaOH、Tris‑HCl、EDTA、甘氨胆酸钠和二巯基丙醇的水溶液；靶序列包括线粒体DNA控制区中的整体或部分。本发明专利技术能够能够简便快速地获得高质量、高纯度、可作为扩增模板的线粒体基因组DNA，且得率高，然后利用黄鲫线粒体DNA控制区对黄鲫遗传信息和遗传多样性进行分析，方法快速准确且简单实用。

Genetic analysis of Carassius auratus using mitochondrial DNA control region

The invention provides a method for genetic analysis of Carassius auratus by using mitochondrial DNA control region, which belongs to the technical field of genetic engineering, including the following steps: adding lysate to muscle tissue samples of Carassius auratus for cracking, then separating supernatant to obtain mitochondrial genomic DNA; screening target sequence of mitochondrial genomic DNA; genetic analysis of Carassius auratus from screening results The target sequence includes the whole or part of mitochondrial DNA control region. The invention can simply and quickly obtain mitochondrial genomic DNA of high quality, high purity and can be used as amplification template with high yield, and then analyze genetic information and genetic diversity of yellow crucian carp by using mitochondrial DNA control region of yellow crucian carp, the method is fast, accurate, simple and practical.

【技术实现步骤摘要】
利用线粒体DNA控制区进行黄鲫遗传学分析的方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种利用线粒体DNA控制区进行黄鲫遗传学分析的方法。
技术介绍
分子标记一般指的是DNA标记，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，目前已广泛应用于海洋生物的遗传学研究。鱼类线粒体DNA(MitochondrialDNA,mtDNA)因为具有结构简单、严格的母系遗传、缺少重组等特点而成为重要的分子标记。线粒体DNA控制区(Controlregion,CR,又称D-loop区)位于线粒体DNA中一段非编码区中tRNAPro和tRNAPhe基因之间，结构略为复杂，进化速率快，容易积累较多的变异(如碱基的替换、插入和缺失等)，被广泛应用于种内分子遗传学研究。即便线粒体DNAD-loop区是线粒体DNA变异最大的区段，但同样存在相对保守的片段。从组成上将控制区可分为3个区段：即终止序列区(extendedterminationassociatedsequences，ETAS)、中央保守区(centralconserveddomain，CD)和保守序列区(conservedsequenceblocks，CSBs)。其中保守序列区和中央保守区较为保守，而突变往往发生在终止序列区这一区段。保守序列区存在CSB-F、CSB-E、CSB-D、CSB-1、CSB-2、CSB-3等多个保守片段，这些片段在许多线粒体DNA中都是高度保守的，暂时还没有发现有突变现象，目前在有关基因功能方面无证据可以验证其功能。目前已分析研究了多种鱼类的线粒体DNA控制区结构，并总结归纳出控制区各保守片段的普遍形式。在部分鱼类线粒体DNA控制区中亦发现长度多态性现象，控制区长度多态性可能应用于种内或种间群体学研究。黄鲫(Setipinnatenuifilis)隶属鲱形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulididae)、黄鲫属，广泛分布于印度洋西部和西北太平洋海域，中国沿海各海域均有分布。黄鲫为近海中下层鱼类，喜栖息于泥沙底、水流较缓的海区。黄鲫是一种小型经济鱼类。20世纪80年代以来，随着小黄鱼、蓝点马鲛、带鱼等传统经济鱼类资源量下降，黄鲫的捕获量逐年增加。由于捕捞压力过大，黄鲫资源量已呈现下降趋势。所以，如何对黄鲫资源进行合理的开发利用，并进行科学的资源保护和修复工作，已成为亟待解决的问题。而利用线粒体DNA控制区序列对不同黄鲫群体的遗传差异和分化程度进行研究，为黄鲫资源的合理利用和科学保护，提供重要的理论依据。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种快速准确且简单实用的利用线粒体DNA控制区进行黄鲫遗传学分析的方法，该检测方法能够能够简便快速地获得高质量、高纯度、可作为扩增模板的线粒体基因组DNA，且得率高。本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：利用线粒体DNA控制区进行黄鲫遗传学分析的方法，包括如下步骤：在黄鲫肌肉组织样本中加入裂解液进行裂解，然后分离上清液，获得线粒体基因组DNA；将线粒体基因组DNA进行靶序列的筛查；从筛查结果进行黄鲫遗传学分析；其中，裂解液为包含NaOH、Tris-HCl、EDTA、甘氨胆酸钠和二巯基丙醇的水溶液；依据线粒体基因组DNA独立于基因组DNA之外且以环状形式存在于细胞中的特征，该裂解液中的各成分能够发挥增益作用，对黄鲫肌肉组织样本细胞及细胞内的蛋白质进行快速的裂解、变性处理，释放出线粒体基因组DNA，减去整个基因组DNA抽提过程，且能减少DNA的降解，所以，能够简便快速地获得高质量、高纯度、可作为扩增模板的线粒体基因组DNA，且得率高；靶序列包括线粒体DNA控制区中的整体或部分。扩增控制区全序列用于控制区结构分析，扩增控制区高变区用于长度多态性分析。优选的，裂解液中NaOH的终浓度0.3-0.4M、Tris-HCl的终浓度0.03-0.05M、EDTA的终浓度4.0-5.0M、甘氨胆酸钠的终浓度6.0-10.0mM，二巯基丙醇的终浓度0.2-0.5mM。优选的，线粒体基因组DNA的OD260/OD280在1.83-1.92之间，OD230/OD260在2.12-2.33之间。优选的，线粒体基因组DNA的浓度＞73.5ng/μL。优选的，筛查使用PCR扩增所述靶序列来实施。更优选的，控制区前段高变区引物为:HJprimer-F：5’-CACGCACTTAGCTCCAAGCTA-3’；HJprimer-R：5’-GACGATACCAGAGTAGTGACG-3’；更优选的，高变区控制区后半段引物为:HJHprimer-F：5’-CAGTCTTCTCTATTCGTCTAG-3’；HJHprimer-R：5’-GTTAGCGAGCTTGATTGCTG-3’。更优选的，PCR反应体系：rTaq0.25μL，DNA模板2μL，primer-F1μL，primer-R1μL，DNTP2μL，10×PCRbuffer2μL，去离子水16.75μL。更优选的，PCR扩增程序为：95℃变性5min；95℃30s，52℃405s，72℃40s，40个循环；72℃延伸5min，4℃保存。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术获取线粒体基因组DNA用裂解液中的各成分能够发挥增益作用，对黄鲫肌肉组织样本细胞及细胞内的蛋白质进行快速的裂解、变性处理，释放出线粒体基因组DNA，减去整个基因组DNA抽提过程，能够简便快速地获得高质量、高纯度、可作为扩增模板的线粒体基因组DNA，且得率高；本专利技术利用黄鲫线粒体DNA控制区对黄鲫遗传信息和遗传多样性进行分析，快速准确且简单实用。本专利技术采用了上述技术方案提供一种利用线粒体DNA控制区进行黄鲫遗传学分析的方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。附图说明图1是本专利技术试验例1中线粒体DNA的纯度和得率。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的部分实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本专利技术公开内容更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本专利技术一实施方式提供了一种利用线粒体DNA控制区进行黄鲫遗传学分析的方法，包括如下步骤：S1：在黄鲫肌肉组织样本中加入裂解液进行裂解，然后分离上清液，获得线粒体基因组DNA；S2：将线粒体基因组DNA进行靶序列的筛查；S3：从筛查结果进行黄鲫遗传学分析；其中，裂解液为包含NaOH、Tris-HCl、EDTA、甘氨胆酸钠和二巯基丙醇的水溶液；依据线粒体基因组DNA独立于基因组DNA之外且以环状形式存在于细胞中的特征，该裂解液中的各成分能够发挥增益作用，对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用线粒体DNA控制区进行黄鲫遗传学分析的方法，其特征在于：包括如下步骤：/n在黄鲫肌肉组织样本中加入裂解液进行裂解，然后分离上清液，获得线粒体基因组DNA；/n将所述线粒体基因组DNA进行靶序列的筛查；/n从筛查结果进行黄鲫遗传学分析；/n其中，所述裂解液为包含NaOH、Tris-HCl、EDTA、甘氨胆酸钠和二巯基丙醇的水溶液；/n所述靶序列包括线粒体DNA控制区中的整体或部分。/n

【技术特征摘要】
1.利用线粒体DNA控制区进行黄鲫遗传学分析的方法，其特征在于：包括如下步骤：
在黄鲫肌肉组织样本中加入裂解液进行裂解，然后分离上清液，获得线粒体基因组DNA；
将所述线粒体基因组DNA进行靶序列的筛查；
从筛查结果进行黄鲫遗传学分析；
其中，所述裂解液为包含NaOH、Tris-HCl、EDTA、甘氨胆酸钠和二巯基丙醇的水溶液；
所述靶序列包括线粒体DNA控制区中的整体或部分。


2.根据权利要求1所述的利用线粒体DNA控制区进行黄鲫遗传学分析的方法，其特征在于：所述裂解液中NaOH的终浓度0.3-0.4M、Tris-HCl的终浓度0.03-0.05M、EDTA的终浓度4.0-5.0M、甘氨胆酸钠的终浓度6.0-10.0mM，二巯基丙醇的终浓度0.2-0.5mM。


3.根据权利要求1或2所述的利用线粒体DNA控制区进行黄鲫遗传学分析的方法，其特征在于：所述线粒体基因组DNA的OD260/OD280在1.83-1.92之间，OD230/OD260在2.12-2.33之间。


4.根据权利要求1或2所述的利用线粒体DNA控制区进行黄鲫遗传学分析的方法，其特征在于：所述线粒体基因组DNA的浓度＞73.5ng/μL。


5.根据权利要求1所述的利用线粒体DNA控制区进...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡珊珊，徐胜勇，高天翔，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33