可切割肽及包含可切割肽的杀昆虫和杀线虫蛋白制造技术

一种由二元肽或三元肽组成的肽，所述肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸，由2或3个不同的区域组成，其中所述二元肽具有2个不同的区域而所述三元肽具有3个不同的区域；其中，所述肽能够被动物肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割。

Cuttable Peptides and Insecticidal and Nematocidal Proteins Containing Cuttable Peptides

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】可切割肽及包含可切割肽的杀昆虫和杀线虫蛋白相关申请的交叉引用本申请是PCT申请，其要求2016年10月21日提交的美国临时申请序列号62/411,117的权益和优先权，该临时申请的公开内容通过引用整体并入本文。序列表本申请通过引用整体并入了名为“FAM_O_PCT_225312_417641_SEQ_LIST_2017_09_29_ST25.txt”(5.37MB)的序列表，该序列表创建于2017年9月29日，并以电子方式随此提交。专利
描述并要求保护新的杀昆虫和杀线虫蛋白、可切割肽、编码它们的DNA构建体、转基因蛋白、它们在植物中的表达、产生转基因蛋白的方法、新方法、生产技术、新肽、新制剂，以及转基因蛋白内所含的产生比用于昆虫和线虫控制的相关杀昆虫和杀线虫蛋白预期更高的有害生物抗性的新的和已知的杀昆虫和杀线虫蛋白的组合。
技术介绍
现代农业和园艺生产的食品的全球安全性受到昆虫有害生物的挑战。农民依靠杀昆虫剂来抑制昆虫损害，但因危险化学品退出市场以及对所有主要类别的化学和生物杀昆虫剂具有抗性的昆虫品系的进化，农民可获得的安全且具功能性的杀昆虫剂的商业选择正在减少。农民必须使用新的杀昆虫剂来维持作物保护。杀昆虫和杀线虫肽、多肽和蛋白是对其靶标(通常是昆虫或线虫)有毒性的肽和蛋白聚合物。杀昆虫肽或毒素通常源自节肢动物来源，诸如源自蝎子或蜘蛛。可以通过注射或通过引诱昆虫从其食物中消耗该毒素(例如昆虫摄食转基因植物)而直接将毒素递送到昆虫的肠道或内脏器官。已知当通过将毒素散布在昆虫栖息的位置将毒素递送给昆虫，或通过喷洒或其他方法将毒素递送至昆虫的环境时，这些毒素具有抑制生长、损害运动或甚至杀灭昆虫的能力。通过直接暴露或摄取，昆虫与毒性肽、多肽或蛋白形成某种形式的接触。然而，杀昆虫肽进入商业市场存在巨大的问题，迄今为止即使有也只有极少数杀昆虫肽经批准并投放商业市场，一个值得注意的例外是源自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)或Bt的肽。目前，人们非常担心昆虫对Bt蛋白的抗性增强。Bt蛋白或Bt肽是植物嵌入式保护剂和叶面喷雾剂形式的用于作物保护的有效杀昆虫剂。Bt蛋白的商业制剂广泛用于控制幼虫期的昆虫。抑制性半胱氨酸结基序(ICK)蛋白也是一类杀昆虫肽，它们源自节肢动物来源，诸如蝎子或蜘蛛的毒液。已经鉴定了其他类别和类型的潜在肽，诸如胰蛋白酶调节抑制因子(TMOF)肽。TMOF肽必须被递送至其生理作用位点以发挥杀昆虫活性。已将TMOF肽鉴定为具有巨大潜力的潜在杀幼虫剂，参见D.Borovsky,JournalofExperimentalBiology206,3869-3875，但与几乎所有其他杀昆虫肽一样，TMOF尚未被商业化或尚未被农民广泛使用，并且这是有原因的。能够以合理和经济的价格成功地以商业规模生产杀昆虫肽，并且肽的形成和折叠可重复，可能是商业化的重大障碍。杀昆虫肽的品种繁多、性能独特且性质特殊，并且可能的生产技术种类很多，可以提供大量肽应用和生产的方法，但很少(如果有的话)在商业上取得成功。有几个原因可以解释为何已经鉴定出的众多杀昆虫肽中如此少被推向市场。第一，大多数杀昆虫肽要么太脆弱要么毒性不足而无法在商业上使用。第二，杀昆虫肽在商业上生产困难且成本高。第三，许多杀昆虫肽迅速降解并且半衰期短。第四，很少有杀昆虫肽在被植物表达时正确折叠，因此它们在经遗传修饰的生物(GMO)诸如经遗传修饰的植物中失去毒性。第五，大多数已鉴定的杀昆虫肽在被昆虫消耗时在昆虫中的系统性分布被阻断和/或丧失其毒性。Bt蛋白是最后这个问题的例外，因为它们扰乱昆虫摄食，因而得以广泛使用。本专利技术为阻止了杀昆虫肽的商业化和广泛使用的这些主要问题提供了几种解决方案。本专利技术提供了转基因蛋白，所述转基因蛋白实现杀昆虫和杀线虫毒性肽的合成及其在活性部位(即昆虫或线虫的肠道或其他器官)处相对大量的释放。通过在宿主细胞区域中的定向表达促进在宿主中的合成，所述定向表达实现转基因蛋白的正确折叠并增强在宿主细胞中的合成。
技术实现思路
本专利技术提供了与毒性杀昆虫和/或杀线虫毒性肽和蛋白融合的可切割肽，所述毒性杀昆虫和/或杀线虫毒性肽和蛋白可在宿主细胞(例如将被昆虫或线虫有害生物消耗的植物细胞)中表达和合成。可切割肽可以在昆虫和/或线虫的肠道环境和/或血淋巴环境中以及在人的胃肠系统中被切割，从而释放其包含一种或多种杀昆虫和/或杀线虫毒性肽和蛋白的有效负载。在第一方面，本专利技术提供了包含二元肽或三元肽的可切割肽，所述二元肽或三元肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸，由2或3个不同的区域组成。在一个实例中，二元肽具有两个不同的区域(昆虫或线虫可切割区域和动物(例如人)肠道可切割区域)，并且三元肽具有二元肽的两个相同区域，但还包括一个在二元肽中未发现的附加区域；并且其中所述二元肽和三元肽可被动物肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割。在一些实施方案中，本专利技术的可切割肽(二元和三元可切割肽(L))不能在植物细胞中被内源性植物蛋白酶切割，或不能被天然存在的植物蛋白酶切割。在相关实施方案中，示例性二元肽包含以下氨基酸序列：X1-X2-Y1-Y2、X1-X2-X3-Y1-Y2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、X1-X2-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Y1-Y2-X1-X2、Y1-Y2-X1-X2-X3、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-X1-X2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4，其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在另一个相关方面，本专利技术的三元肽包含至少5个氨基酸，最多16个氨基酸；其中所述三元肽包含二元肽和1至4个氨基酸的间隔区。在一些实施方案中，如本文所公开的那样，间隔区包含氨基酸序列GS并且框内融合至二元肽的N末端，或所述二元肽的C末端，或二元肽的N末端和C末端两者。在第二方面，本专利技术提供了杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其具有与杀昆虫或杀线虫毒性蛋白框内融合的可切割肽(二元肽或三元肽)。在另一个实施方案中，本专利技术提供了具有两种或更多种可切割肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述杀昆虫和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种由二元肽或三元肽组成的肽，所述肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸，由2或3个不同的区域组成，其中所述二元肽具有2个不同的区域而所述三元肽具有3个不同的区域；其中，所述二元肽和三元肽能够被动物肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.21 US 62/411,1171.一种由二元肽或三元肽组成的肽，所述肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸，由2或3个不同的区域组成，其中所述二元肽具有2个不同的区域而所述三元肽具有3个不同的区域；其中，所述二元肽和三元肽能够被动物肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割。2.如权利要求1所述的肽，其中所述二元肽包含至少4个氨基酸且最多8个氨基酸；并且所述肽包含2个不同的区域，其中所述区域中的一个能够被动物肠道蛋白酶切割而另一个区域能够被昆虫或线虫肠道蛋白酶切割。3.如权利要求1所述的肽，其中所述三元肽包含至少5个氨基酸，最多16个氨基酸；并且所述三元肽包含二元肽和1至4个氨基酸的间隔区。4.如权利要求3所述的肽，其中所述间隔区包含氨基酸序列GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT。5.如权利要求1-4中任一项所述的二元肽，其中所述二元肽包含选自以下的氨基酸序列：X1-X2-Y1-Y2、X1-X2-X3-Y1-Y2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、X1-X2-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Y1-Y2-X1-X2、Y1-Y2-X1-X2-X3、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-X1-X2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4，其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。6.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述二元肽具有以下氨基酸序列：AFVRLF、AKLFV、ALFALK、ALFLK、ALFLR、ALFR、ALFRLR、ALKALF、ALKFF、ALKFLV、ALKIFV、ALKLFV、FFADIK、FFALK、FFLK、FFLR、FFRLR、FGYRIK、FLRLF、FYARR、GGLRKK、IFVALK、IFVLK、IFVLR、IFVR、IFVRLR、ILFNIK、LFAAPF、FVALK、LFVLK、LFVLR、LFVR、LFVRLR、LFVRVFL、LGER、LKALF、LKFF、LKIFV、LKLFV、LRALF、LRFF、LRIFV、LRLFV、RALF、RIFV、RLFV、RLRALF、RLRFF、RLRIFV、RLRLFV、RRKAFV、RRKLIF、RRRFFA、VFGRKG和YFVRK。7.如权利要求6所述的肽，其中所述二元肽具有以下氨基酸序列：IFVALK、IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV、LFAAPF、LFVALK、LRLFV、LFVRLR或LKLFV。8.如权利要求1所述的肽，其中所述三元肽包含以下氨基酸序列：IFVALKGS、IFVRLRGS、ALKLFVGS、ALKFLVGS、RRKAFVGS、LFAAPFGS、LFVALKGS、LRLFVGS、LFVRLRGS或LKLFVGS。9.如权利要求1-7中任一项所述的肽，其中所述二元肽具有氨基酸序列IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF。10.如权利要求1-9所述的肽，其中所述三元肽包含以下氨基酸序列：IFVRLRGS、ALKLFVGS、ALKFLVGS、RRKAFVGS、LFAAPFGS、GSIFVRLR、GSALKLFV、GSALKFLV、GSGSRRKAFV或GSLFAAPF。11.如权利要求1-10中任一项所述的肽，其中所述二元肽或三元肽与毒性蛋白(TP)连接。12.如权利要求11所述的肽，其还包含与所述TP的C末端框内连接的第二二元肽或三元肽。13.如权利要求1-12中任一项所述的肽，其中所述二元肽或三元肽与内质网信号肽(ERSP)的C末端连接。14.一种具有一种或多种可切割连接肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽的N末端框内融合的ERSP，所述二元肽或三元肽与构建体框内融合，所述构建体包含：(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n，其中TP是毒性蛋白，L是二元肽或三元肽并且n是1至200范围内的整数。15.如权利要求1-14中任一项所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述昆虫蛋白酶是源自鳞翅目或鞘翅目昆虫的种的蛋白酶。16.如权利要求1-15中任一项所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述动物肠道蛋白酶是人胃肠蛋白酶。17.如权利要求1-16中任一项所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述TP是选自成孔杀昆虫蛋白(PFIP)和富半胱氨酸杀昆虫蛋白(CRIP)的蛋白。18.如权利要求1-17中任一项所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述TP是与具有如SEQIDNO:5-1593和1761-1775所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的肽或蛋白。19.如权利要求1-18中任一项所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述TP是与具有如5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的肽或蛋白，及其变体。20.如权利要求19所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述TP是具有SEQIDNO:5、6、1761、1762、1767、1771-1773中任一个的氨基酸序列的肽，或其变体。21.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-20中任一项所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白。22.一种载体，其包含如权利要求21所述的多核苷酸。23.一种细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、植物宿主细胞或动物宿主细胞，其包含如权利要求22所述的载体。24.一种DNA构建体，其包含与可操作启动子连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码：包含二元肽或三元肽的可切割肽，所述可切割肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸并且由2或3个不同的区域组成，其中所述二元肽具有2个不同的区域而所述三元肽具有3个不同的区域；其中所述可切割肽能够被动物肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割，并且所述多核苷酸还编码与所述可切割肽框内融合的毒性肽。25.如权利要求24所述的DNA构建体，其中所述三元肽包含至少5个氨基酸，最多16个氨基酸；并且所述三元肽包含二元肽和1至4个氨基酸的间隔区。26.如权利要求25所述的DNA构建体，其中所述间隔区包含氨基酸序列GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT。27.如权利要求24-26中任一项所述的DNA构建体，其中所述二元肽包含以下的氨基酸序列：X1-X2-Y1-Y2、X1-X2-X3-Y1-Y2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、X1-X2-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Y1-Y2-X1-X2、Y1-Y2-X1-X2-X3、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-X1-X2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4，其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。28.如权利要求27所述的DNA构建体，其中所述二元肽包含以下氨基酸序列：AFVRLF、AKLFV、ALFALK、ALFLK、ALFLR、ALFR、ALFRLR、ALKALF、ALKFF、ALKFLV、ALKIFV、ALKLFV、FFADIK、FFALK、FFLK、FFLR、FFRLR、FGYRIK、FLRLF、FYARR、GGLRKK、IFVALK、IFVLK、IFVLR、IFVR、IFVRLR、ILFNIK、LFAAPF、FVALK、LFVLK、LFVLR、LFVR、LFVRLR、LFVRVFL、LGER、LKALF、LKFF、LKIFV、LKLFV、LRALF、LRFF、LRIFV、LRLFV、RALF、RIFV、RLFV、RLRALF、RLRFF、RLRIFV、RLRLFV、RRKAFV、RRKLIF、RRRFFA、VFGRKG和YFVRK。29.如权利要求28所述的DNA构建体，其中所述二元肽包含以下氨基酸序列：IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF。30.如权利要求24所述的DNA构建体，其中所述多核苷酸编码包含以下氨基酸序列的三元肽：AFVRLFGS、AKLFVGS、ALFALKGS、ALFLKGS、ALFLRGS、ALFRGS、ALFRLRGS、ALKALFGS、ALKFFGS、ALKFLVGS、ALKIFVGS、ALKLFVGS、FFADIKGS、FFALKGS、FFLKGS、FFLRGS、FFRLRGS、FGYRIKGS、FLRLFGS、FYARRGS、GGLRKKGS、IFVALKGS、IFVLKGS、IFVLRGS、IFVRGS、IFVRLRGS、IL...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·R·卡尔森，A·M·哈泽，R·M·甘乃迪，
申请(专利权)人：韦斯塔隆公司，
类型：发明
国别省市：美国,US