用于害虫防治的MU-沙漠灌木蛛毒素-DC1A变体多肽制造技术

本发明专利技术公开了新的杀昆虫肽、多肽、蛋白质和核苷酸；它们在培养基和植物中的表达；生产这些肽、多肽、蛋白质和核苷酸的方法；新工艺；新的生产技术；新的制剂；和新的生物体。本发明专利技术还涉及一种命名为Dc1a

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于害虫防治的MU
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沙漠灌木蛛毒素
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DC1A变体多肽
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年9月28日提交的美国临时申请序列号63/084,339的权益和优先权。上述申请的全部内容均并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请全文以引用方式并入名称为“225312
‑
497884_ST25.txt”(126千字节)的序列表，该序列表创建于2021年9月27日下午6:32，为126KB，并在此以电子方式提交。


[0005]本公开提供了杀昆虫蛋白、核苷酸、肽、它们在植物中的表达、产生这些肽的方法、新的制剂，以及描述了用于防治昆虫的方法。

技术介绍

[0006]有害昆虫对人类健康和粮食安全构成了全球性的威胁。昆虫对人类健康构成威胁，因为它们是疾病的媒介。蚊子是最臭名昭著的疾病媒介昆虫之一。按蚊属(Anopheles)的蚊子是寨卡病毒、基孔肯雅病毒和疟疾的主要媒介，疟疾是由锥虫属(Trypanosoma)的原生动物引起的疾病。另一种蚊子，埃及伊蚊(Aedes aegypti)是引起黄热病和登革热的病毒的主要媒介。并且伊蚊属(Aedes)物种的蚊子也是导致各种类型脑炎的病毒的媒介。班氏丝虫(Wuchereria bancrofti)和马来丝虫(Brugia malayi)是引起丝虫病的寄生蛔虫，通常由库蚊属(Culex)、曼蚊属(Mansonia)和按蚊属的蚊子传播。
[0007]与蚊子相似，双翅目(Diptera)中的其他成员自古以来同样也困扰着人类。除了产生疼痛的叮咬以外，马蝇和鹿蝇可传播兔热病(土拉巴斯德氏菌(Pasteurella tularensis))和炭疽(炭疽杆菌(Bacillus anthracis))的细菌性病原体，以及在热带非洲引起罗阿丝虫病的寄生蛔虫(罗阿丝虫)。
[0008]丽蝇(大头金蝇(Chrysomya megacephala))和家蝇(普通家蝇(Musca domestica))将在一瞬间从腐肉和粪便中起飞，并在下一瞬间飞到我们的家中以及我们的食物上，从而在它们身后传播痢疾、伤寒、霍乱、脊髓灰质炎、雅司病、麻风病和结核病。
[0009]潜蝇属(Hippelates)的眼潜蝇可携带引起雅司病(雅司螺旋体(Treponema pertenue))的螺旋菌病原体，并且也可传播结膜炎(红眼病)。舌蝇属(Glossina)的采采蝇传播引起非洲昏睡病的原生动物病原体(冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)和罗得西亚锥虫(T.rhodesiense))。白蛉属(Phlebotomus)中的白蛉是在南美洲引起卡里翁氏病(奥罗亚热)的细菌(杆菌状巴通体(Bartonella bacilliformis))的媒介。在亚洲和北非的部分地区，它们传播引起白蛉热(三天热)的病毒因子以及引起利什曼病的原生动物病原体(利什曼原虫(Leishmania)属)。
[0010]人类食物安全也受到昆虫的威胁。昆虫害虫无差别地以专用于商业目的和个人用途的粮食作物为目标；实际上，由昆虫害虫造成的损害可涵盖广泛范围，从前者单纯的不便到经济破坏，再到后者营养不良或饥饿等极端情况。昆虫害虫也会对家养动物造成压力和
疾病。并且，由于全球旅行和气候变化，曾经受制于地理和气候边界的昆虫害虫已经扩大了它们的范围。

技术实现思路

[0011]本公开描述了具有对一种或多种昆虫物种的杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)。此处，DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A
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V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X
10
为L、A、N、V、S、E、I或Q；X
11
为C、F、A、T、S、M或V；并且X
12
为V、A或T；或其药学上可接受的盐。
[0012]此外，本公开描述了由DVP、DVP杀昆虫蛋白或它们的组合和赋形剂组成的组合物。
[0013]本公开描述了用于编码DVP的多核苷酸，其中DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A
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‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A
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V，其中所述多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X
10
为L、A、N、V、S、E、I或Q；X
11
为C、F、A、T、S、M或V；并且X
12
为V、A或T；或其药学上可接受的盐。2.根据权利要求1所述的DVP，其中如果X9为G、T、A、S、M或V，或者X
11
为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。3.根据权利要求1所述的DVP，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6
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43、45
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51、53、128、130、136、139
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140、144、146
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191、202
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215或217
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219；或其药学上可接受的盐。4.根据权利要求3所述的DVP，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6
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11、15
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16、20
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219；或其药学上可接受的盐。5.根据权利要求4所述的DVP，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139
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219；或其药学上可接受的盐。6.根据权利要求1所述的DVP，其中所述DVP是两种或更多种DVP的均聚物或杂聚物，其中每种DVP的氨基酸序列相同或不同。7.根据权利要求1所述的DVP，其中所述DVP是融合蛋白，所述融合蛋白包含由可切割接头或不可切割接头分离的两种或更多种DVP，并且其中每种DVP的氨基酸序列可相同或不同。8.根据权利要求7所述的DVP，其中所述可切割接头在昆虫的肠道或血淋巴内是可切割的。9.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1至8中任一项所述的DVP或其组合和赋形剂。10.一种用于编码DVP的多核苷酸，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A
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V，其中所述多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X
10
为L、A、N、V、S、E、I或Q；X
11
为C、F、A、T、S、M或V；并且X
12
为V、A或T；或它们的互补核苷酸序列。11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中如果所述多核苷酸编码DVP，其中如果X9为G、T、A、S、M或V，或者X
11
为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。12.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DVP，所述DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6
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43、45
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51、53、128、130、136、139
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215或217
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219。13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DVP，所述DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6
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11、15
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16、20
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22、24
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219。14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DVP，所述DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139
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219。15.一种生产DVP的方法，所述方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，所述第一表达盒包含用于编码DVP的多核苷酸和/或其互补核苷酸序列，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A
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V，其中所述多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X
10
为L、A、N、V、S、E、I或Q；X
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为C、F、A、T、S、M或V；并且X
12
为V、A或T；(b)将所述载体引入酵母细胞；以及(c)在用于能够使所述DVP表达和分泌到生长培养基中的条件下，在所述生长培养基中培养所述酵母细胞。16.根据权利要求15所述的方法，其中如果X9为G、T、A、S、M或V，或者X
11
为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6
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51、53、128、130、136、139
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191、202
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219；或其药学上可接受的盐。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6
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11、15
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219；或其药学上可接受的盐。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139
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191、210
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219；或其药学上可接受的盐。20.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP是两种或更多种DVP的均聚物或杂聚物，其中每种DVP的氨基酸序列相同或不同。21.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP是融合蛋白，所述融合蛋白包含由可切割接头或不可切割接头分离的两种或更多种DVP，并且其中每种DVP的氨基酸序列可相同或不同。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述可切割接头在昆虫的肠道或血淋巴内是可切割的。23.根据权利要求15所述的方法，其中所述载体是包含α
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MF信号的质粒。24.根据权利要求15所述的方法，其中所述载体转化到酵母细胞中。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述酵母细胞选自酵母(Saccharomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、汉逊酵母(Hansenula)属、耶氏酵母(Yarrowia)属或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属的任何物种。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述酵母细胞选自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述酵母细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。28.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP分泌到所述生长培养基中。29.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP的表达提供了：每升酵母培养基至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L、200mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1,000mg/L、至少1,250mg/L、至少1,500mg/L、至少1,750mg/L、至少2,000mg/L、至少2,500mg/L、至少3,000mg/L、至少3,500mg/L、至少4,000mg/L、至少4,500mg/L、至少5,000mg/L、至少5,500mg/L、至少6,000mg/L、至少6,500mg/L、至少7,000mg/L、至少7,500mg/L、至少8,000mg/L、至少8,500mg/L、至少9,000mg/L、至少9,500mg/L、至少10,000mg/L、至少11,000mg/L、至少12,000mg/L、至少12,500mg/L、至少13,000mg/L、至少14,000mg/L、至少15,000mg/L、至少16,000mg/L、至少17,000mg/L、至少17,500mg/L、至少18,000mg/L、至少19,000mg/L、至少20,000mg/L、至少25,000mg/L、至少30,000mg/L、至少40,000mg/L、至少50,000mg/L、至少60,000mg/L、至少70,000mg/L、至少80,000mg/L、至少90,000mg/L或至少100,000mg/L的DVP的产量。30.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP在所述培养基中的表达导致单个DVP在所述培养基中的表达。31.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP在所述培养基中的表达导致包含两种或更多种DVP多肽的DVP聚合物在所述培养基中的表达。32.根据权利要求15所述的方法，其中所述载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒用于编码所述第一表达盒的所述DVP。33.根据权利要求15所述的方法，其中所述载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒用于编码所述第一表达盒的所述DVP，或不同表达盒的DVP。34.根据权利要求15所述的方法，其中所述表达盒用于编码DVP，所述DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6
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219。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述表达盒用于编码DVP，所述DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6
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11、15
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16、20
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219。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述表达盒用于编码DVP，所述DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139
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219。37.一种对抗、防治或抑制害虫的方法，包括将杀虫有效量的根据权利要求9所述的组
合物施用到所述害虫所在处，或施用到易受所述害虫侵袭的植物或动物。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述害虫选自：Achema Sphinx Moth(天蛾幼虫)(Eumorpha achemon)；苜蓿粉蝶(纹黄豆粉蝶(Colias eurytheme))；粉斑螟蛾(Caudra cautella)；Amorbia Moth(Amorbia humerosana)；粘虫(灰翅夜蛾属(Spodoptera)物种，例如甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、棉贪夜蛾、一星粘虫)；洋蓟羽蛾(Platyptilia carduidactyla)；杜鹃花毛虫(Datana major)；结草虫(常绿树蓑蛾(Thyridopteryx ephemeraeformis))；香蕉蛾(木豹蛾(Hypercompe scribonia))；香蕉弄蝶(Erionota thrax)；黑头芽虫(西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana))；加州槲蛾(Phryganidia californica)；春尺蠖(Paleacrita merriccata)；Cherry Fruitworm(樱小食心虫(Grapholita packardi))；China Mark Moth(圹水螟(Nymphula stagnata))；柑橘地老虎(柑橘夜蛾(Xylomyges curialis))；苹果蠹蛾(苹果小卷蛾(Cydia pomonella))；蔓越莓果虫(越橘蜂斑螟(Acrobasis vaccinii))；十字条纹菜青虫(卷心菜薄翅野螟(Evergestis rimosalis))；地老虎(夜蛾科(Noctuid)物种、小地老虎(Agrotis ipsilon))；道格拉斯冷杉毒蛾(枞树毒蛾(Orgyia pseudotsugata))；Ello Moth(天蛾幼虫)(木薯天蛾(Erinnyis ello))；榆树尺蠖(榆秋黄尺蛾(Ennomos subsignaria))；欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana))；欧洲弄蝶(无斑豹弄蝶(Thymelicus lineola)；Essex Skipper；秋幕毛虫(Melissopus latiferreanus)；Filbert Leafroller(蔷薇黄卷蛾(Archips rosanus))；果树卷叶蛾(果树黄卷蛾(Archips argyrospilia))；葡萄浆果蛾(Paralobesia viteana)；荷兰石竹小卷蛾(Platynota stultana)；葡萄叶雕叶虫(葡萄烟翅蛾(Harrisina americana))；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)；Greenstriped Mapleworm(玫瑰栎蚕蛾(Dryocampa rubicunda))；Gummosos
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Batrachedra comosae(Hodges)；舞毒蛾(Lymantria dispar)；铁杉尺蠖(东方铁杉尺蠖(Lambdina fiscellaria))；天蛾幼虫(烟草天蛾属(Manduca)物种)；菜粉蝶(Pieris rapae)；玉米天蚕蛾(玉米尺蚕蛾(Automeris io))；贾克松色卷蛾(Choristoneura pinus)；苹果浅褐卷叶蛾(苹淡褐卷蛾(Epiphyas postvittana))；瓜虫(甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata))；合欢巢蛾(含羞草雕蛾(Homadaula anisocentra))；斜纹卷叶虫(蔷薇斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana))；夹竹桃蛾(夹竹桃蛾幼虫(Syntomeida epilais))；杂食性卷叶蛾(Playnota stultana)；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata)；柑桔凤蝶(大黄带凤蝶(Papilio cresphontes))；桔卷叶蛾(桔带卷蛾(Argyrotaenia citrana))；梨小食心虫(东方果蛾(Grapholita molesta))；桃条麦蛾(桃枝麦蛾(Anarsia lineatella))；松蝴蝶(娆粉蝶(Neophasia menapia))；豆荚虫；红带卷叶蛾(红带卷蛾(Argyrotaenia velutinana))；红疣天社蛾(Schizura concinna)；Rindworm Complex(各种鳞翅目昆虫)；鞍背刺蛾毛虫(鞍背毛虫(Sibine stimulea))；鞍突毛虫(鞍背天社蛾(Heterocampa guttivitta))；盐沼毛虫(盐泽灯蛾(Estigmene acrea))；草地螟(草螟属(Crambus)物种)；尺蠖(榆秋黄尺蠖(Ennomos subsignaria))；秋星尺蠖(秋尺蠖(Alsophila pometaria))；云杉卷叶蛾(云杉色卷蛾(Choristoneura fumiferana))；天幕毛虫(各种枯叶蛾(Lasiocampidae))；萝褐灰蝶(Geyr)(菠萝褐灰蝶(Thecla basilides))；烟草天蛾(Manduca sexta)；烟草灰绿斑蛾(烟草粉螟(Ephestia elutella))；Tufted Apple Budmoth(簇生苹果芽蛾(Platynota idaeusalis))；桃条麦蛾(桃枝麦蛾(Anarsia lineatella))；豆杂色夜蛾(疆夜蛾
(Peridroma saucia))；杂色卷叶蛾(Platynota flavedana)；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)；胡桃毛虫(Datana integerrima)；结网毛虫(美国白蛾(Hyphantria cunea))；西部栎柳毒蛾(老古毒蛾(Orgyia vetusta))；南方玉米螟(Diatraea crambidoides)；玉米穗虫；甘薯小象甲；胡椒茎象甲；桔根象甲；草莓根象甲；美核桃象甲；榛象甲；稻水象甲；苜蓿叶象甲；三叶草象甲；茶枝小蠹虫；根象甲；甘蔗犀金龟；咖啡果小蠹；一年生蓝草象鼻虫(Listronotus maculicollis)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟(Maladera castanea))；欧洲金龟子(Rhizotroqus majalis)；绿花金龟(绿六月花金龟(Cotinis nitida))；日本金龟子(日本弧丽金龟(Popillia japonica))；五月或六月甲虫(六月鳃角金龟属(Phyllophaga)物种)；圆头犀金龟(北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis))；东方丽金龟(Anomala orientalis)；南方蒙面金龟子(南方圆头犀金龟(Cyclocephala lurida))；谷象(象甲总科(Curculionoidea))；埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾(Busseola fusca)；水稻二化螟(Chilo suppressalis)；尖音库蚊(Culex pipiens)；致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)；小蔗螟(Diatraea saccharalis)；棉铃虫(Helicoverpa armigera)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)；绿棉铃虫(Heliothis virescens)；马铃薯甲虫；亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)；玉米螟(Ostrinia nubilalis)；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)；印度谷螟(Plodia interpunctella)；吊丝虫(Plutella xylostella)；大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)；玉米夜蛾(Spodoptera exigua)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)；和榆叶甲(Xanthogaleruca luteola)。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述害虫选自：埃及伊蚊(Aedes aegypti)；玉米茎蛀褐夜蛾(Busseola fusca)；水稻二化螟(Chilo suppressalis)；尖音库蚊(Culex pipiens)；致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)；小蔗螟(Diatraea saccharalis)；棉铃虫(Helicoverpa armigera)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)；绿棉铃虫(Heliothis virescens)；马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)；亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)；玉米螟(Ostrinia nubilalis)；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)；印度谷螟(Plodia interpunctella)；吊丝虫(Plutella xylostella)；大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)；玉米夜蛾(Spodoptera exigua)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)；和榆叶甲(Xanthogaleruca luteola)。40.一种包含用于编码DVP的多核苷酸的载体，所述DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6
‑
43、45
...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：韦斯塔隆公司，
类型：发明
国别省市：