一种修复PCBs污染土壤的转基因拟南芥制造技术

一种修复PCBs污染土壤的转基因拟南芥，本发明专利技术包括：亚克隆来自于土壤宏基因组的TfdB和BphC基因；共表达TfdB+BphC植物通过植物表达载体的构建、农杆菌介导的植物遗传转化、筛选转基因阳性植株、转基因植株修复PCB 28污染土壤等步骤获得；在拟南芥体内构建类似细菌降解PCBs的通路，提高拟南芥对PCBs的耐受能力，降低PCB28对植物生长的限制，提高植物修复PCBs污染土壤的效能，获得新型的PCBs污染土壤的植物修复材料；在降低污染物对生态系统的威胁与提升PCBs植物修复生态安全性方面，具有很好的应用前景。

A Genetically Modified Arabidopsis thaliana for Rehabilitation of PCBs Contaminated Soil

A transgenic Arabidopsis thaliana for repairing PCBs contaminated soil includes: subcloning TfdB and BphC genes from soil macrogenome; co-expressing TfdB+BphC plants are obtained by plant expression vector construction, Agrobacterium-mediated plant genetic transformation, screening of transgenic plants, repairing PCB 28 contaminated soil by transgenic plants, and constructing similar fine plants in Arabidopsis thaliana. The pathway of bacterial degradation of PCBs can improve the tolerance of Arabidopsis thaliana to PCBs, reduce the restriction of PCB28 on plant growth, improve the efficiency of phytoremediation of PCBs-contaminated soil, and obtain new PCBs-contaminated soil phytoremediation materials. It has good application prospects in reducing the threat of pollutants to ecosystems and improving the ecological safety of PCBs phytoremediation.

【技术实现步骤摘要】
一种修复PCBs污染土壤的转基因拟南芥
本专利技术属生物修复及环境保护
，特别是利用转基因植物修复有机物污染土壤。
技术介绍
(1)多氯联苯的危害及污染现状多氯联苯(PolychlorinatedBiphenyls，PCBs)一类人工合成的环境异源物质，其特征为联苯环上的氢原子被1-10个氯原子所取代，理论上共有209种同系物。PCBs具有良好的热化学稳定性，抗氧化性和绝缘性，曾在全球范围内作为电容器的绝缘介质(如变压器油)被广泛应用。但由于微量的PCBs就可对生物体产生致癌、致畸和致突变等作用，并且其具有远距离迁移、生物富集及难降解性，PCBs已被《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》列为12种持久性有机污染物(PersistentOrganicPollutants，POPs)之一。(2)PCBs污染土壤修复研究现状国内外对PCBs污染土壤的治理，可分为物理修复、化学修复和生物修复等。虽然物理和化学修复方法也在深入研究和改进，但是仍然存在着成本高、能耗高、工艺复杂、破坏土壤结构，易造成环境二次污染等问题。而生物修复(微生物修复、植物修复和植物-微生物联合修复)，因具有低成本、应用性强、对环境友好、并可最大程度保持土壤基本性质不变等特点，一直为国内外学术界所关注。但已有研究表明，大多数微生物只能降解低氯代的PCBs，并且微生物活性容易受环境条件的影响，致使PCBs污染土壤微生物修复效能低下，因此植物修复已经成为PCBs污染土壤生物修复研究的热点。(3)植物修复及其限制因素植物根际修复PCBs污染土壤，在盆栽和温室模拟试验研究中获得了较为理想的结果，但是在实际场地修复过程中，往往达不到预期效果，其原因主要包括：A.植物吸收土壤中PCBs后，生长发育受到抑制；主要原因之一在于植物体内缺乏类似细菌的能使联苯开环的2,3-二羟基联苯双加氧酶(BphC)。B.PCBs强烈吸附于土壤介质中，生物可利用性差；C.微生物中催化PCBs分解代谢的基因表达水平低，不能有效降解PCBs。(4)转基因植物修复近年来，应用转基因技术对修复植物进行遗传改造，已大幅度改善了修复植物对PCBs的耐受、吸收和转化能力。如将细菌BphC基因转入烟草，能够减轻羟基化多氯联苯对烟草的毒害作用，并增强其代谢PCBs的能力。申请者在前期工作中，将一个新BphC基因转入紫花苜蓿，其耐受性显著优于野生型苜蓿。然而，进一步分析发现单羟基氯代联苯的降解并不显著，植物体内存在大量的单羟基氯代联苯，对植物仍有毒害作用，对生态系统的威胁仍然存在。因为修复植物体内积累了大量PCBs，仍是危险废物，需做进一步处理；并且植物体内的羟基化氯代联苯由于水溶性的增强，其毒性强于母体PCBs。因此有必要将单羟基的氧化酶(Tfdb-Jlu酶)转入到植物体内，构建共表达TfdB和BphC的转基因植株，预期在植物体内建立起类似于微生物降解PCBs的通路，进而高效清除植物体内残留PCBs，降低污染物对生态系统的威胁，提升PCBs植物修复生态安全性的潜力和实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术的转基因拟南芥中共表达TfdB、BphC基因，TfdB酶具有2,4-二氯苯酚羟化酶活性，BphC酶具有2,3-二羟基联苯双加氧酶活性。本专利技术的转基因拟南芥能在修复PCBs污染土壤中得到应用。本专利技术的转基因拟南芥能修复有机污染物，有机污染物为：联苯、多氯联苯、二噁英、3-甲基邻苯二酚、卤代邻苯二酚和多环芳烃。以修复植物为受体，采用农杆菌介导转化法，将TfdB基因和BphC基因转入受体植物，获得共表达TfdB+BphC的转基因植株，能有效清除植物体内残留的机污染物，为高效去除土壤中机污染物提供新的植物修复技术体系，对有机物污染土壤原位植物修复技术的发展，具有积极的理论意义和实用价值。本专利技术具有如下优点：1.将可增强植物对有机污染物羟基化和苯环开环的基因在植物体内共表达，高效清除植物体内积累的有机污染物，提高植物对有机污染物的耐受性和积累能力。2.本专利技术的转基因拟南芥能显著提高对多氯联苯等难溶性有机污染土壤的修复效能。附图说明图1为共表达TfdB+BphC拟南芥BphC基因PCR电泳图其中：M：DNAmaker，DL2000；1：pCAMBIA3300N+TfdB+BphC质粒；2-16：共表达TfdB+BphC拟南芥；17：野生型拟南芥；18：空白对照图2为共表达TfdB+BphC拟南芥TfdB基因PCR电泳图其中：M：DNAmaker，DL2000；1：pCAMBIA3300N+TfdB+BphC质粒；2-6：共表达TfdB+BphC拟南芥；7：野生型拟南芥；8：空白对照图3为转基因拟南芥的Westernblot鉴定其中：1、2：共表达TfdB+BphC拟南芥；3、4：转BphC拟南芥；5、6：转TfdB拟南芥、7、8：野生型拟南芥图4为转基因拟南芥BphC酶活性其中：T-b1～7：共表达TfdB+BphC拟南芥；B-1～5：转BphC基因拟南芥；T：转TfdB拟南芥；WT：野生型拟南芥(注：图中不同小写字母表示在p＜0.05水平差异显著)图5为转基因拟南芥TfdB酶活性其中：T-b1～7：共表达TfdB+BphC拟南芥；T-2～6：转TfdB拟南芥；B：转BphC基因拟南芥；WT：野生型拟南芥(注：图中不同小写字母表示在p＜0.05水平差异显著)图6为转基因拟南芥对PCB28的耐受性其中：1:转BphC拟南芥；2:转TfdB拟南芥；3:共表达TfdB+BphC拟南芥；4:野生型拟南芥图7为转基因拟南芥体内PCB28的含量图8为培养液中PCB28的去除率图9为转基因拟南芥修复PCB28污染土壤其中：A：植株生长30天；B：植株生长80天；a：野生型拟南芥；b：转BphC拟南芥；c：转TfdB拟南芥；d：共表达TfdB+BphC拟南芥图10为拟南芥体内PCB28的含量图11为土壤中PCB28的去除率图10和图11中：TfdB+BphC：共表达TfdB+BphC拟南芥；TfdB：转TfdB拟南芥；BphC：转BphC拟南芥；WT：野生型拟南芥(注：图中不同小写字母表示在p＜0.05水平差异显著)具体实施方式实施例1：共表达TfdB+BphC植物筛选2,4-二氯苯酚羟化酶基因(TfdB)是来至于土壤宏基因组文库，研究表明TfdB酶对氯酚类底物、联苯类底物以及除了3-甲基吲哚以外的所有吲哚类底物都有一定的活性。2,3-二羟基加氧酶(BphC)基因也来至于土壤宏基因组文库，2,3-二羟基加氧酶是植物缺少的能将羟基化联苯开环的关键基因。(1)TfdB和BphC基因的亚克隆亚克隆来源于土壤宏基因组的2,4-二氯苯酚羟化酶TfdB基因(GQ403987.1)和2,3-二羟基联苯双加氧酶BphC基因(GQ403988.1)。以实验室保存的质粒为模板，利用含有酶切位点的引物FBphC和RBphC扩增BphC基因；利用引物FTfdB和RTfdB扩增TfdB基因。FBphC：5’-GGAAGATCTATGGTAGCAGTCACGGAAC-3’,RBphC：5’-ACTGGACACGTGACTAGTATGCCATGGGCCGAGGGGAATATCCATT-3’；FTfdB：5’-CTAGTCTAGAATGAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因拟南芥，其特征在于,拟南芥中共表达TfdB、BphC基因，TfdB酶具有2,4‑二氯苯酚羟化酶活性，BphC酶具有2,3‑二羟基联苯双加氧酶活性。

【技术特征摘要】
1.一种转基因拟南芥，其特征在于,拟南芥中共表达TfdB、BphC基因，TfdB酶具有2,4-二氯苯酚羟化酶活...

【专利技术属性】
技术研发人员：王岩，任何军，张若男，张玉芩，杨茹，杨凤，张嘉贺，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22