一种昆虫病原线虫一级种源制备方法技术

本发明专利技术公开了一种昆虫病原线虫一级种源制备方法，其特征在于：具体步骤包括：材料器材准备，配制培养基，大蜡螟幼虫灭菌，配制线虫液，接种，观察记录，获取线虫一级种源。本发明专利技术通过大蜡螟活体培养，经表面消毒后得到的线虫一级种源可以解决种虫退化问题，降低生产成本，发展前景好，对昆虫病原线虫的规模化生产和对地下害虫的生物防治具有非常重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物繁殖培养的
，特别是昆虫病原线虫一级种源制备方法的

技术介绍
地下害虫，指的是一生或一生中某个阶段生活在土壤中危害植物地下部分、种子、幼苗或近土表主茎的杂食性昆虫。地下害虫是农作物的大敌，危害种子、幼芽、根茎，造成缺苗，甚至毁种，导致农作物减产，尤以蛴螬、蝼蛄、地老虎、金针虫的危害最为严重。目前，地下害虫防治仍以化学杀虫剂为主，但效果不够理想，且易造成环境污染、威胁人体健康等负面影响。通过高毒化学农药或加大农药施用量来控制地下害虫，不仅导致其抗药性大幅度提高，还严重影响农作物的品质。因此，在农药污染日益严重、地下害虫抗药性发展迅速的今天，昆虫病原线虫已成为可持续发展农业的迫切需要，受到国际生防领域的重视，特别是斯氏科线虫和异小杆科线虫，已成为当前国际生防领域研究热点之一。昆虫病原线虫是昆虫的专化性寄生天敌，是以昆虫为寄主的致病性线虫，一般专指斯氏线虫科和异小杆线虫科两类。昆虫病原线虫肠道内携带共生细菌，它们互惠共生，作为昆虫的“蛔虫”与其体内专化性携带的共生细菌一起致死寄主昆虫。它们搜索寄主能力强，侵染致死有效性高，起效时间快，对人畜、天敌、环境安全，是一类重要的害虫生物防治因子，已广泛应用于防治蛴螬、蝼蛄、地老虎、金针虫等多种地下害虫。昆虫病原学线虫的培养主要分为活体培养和离体培养，离体培养又分为固体培养和液体培养。固体海绵培养基培养昆虫病原线虫，一级种虫经过多代繁殖后，会遇到种虫退化的问题，具体表现为线虫活力、产量下降。
技术实现思路
本专利技术的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种昆虫病原线虫一级种源制备方法，通过大蜡螟活体培养，经表面消毒后得到的线虫可以解决种虫退化问题，降低生产成本，发展前景好，对昆虫病原线虫的规模化生产和对地下害虫的生物防治具有非常重要的意义。为实现上述目的，本专利技术提出了一种昆虫病原线虫一级种源制备方法，具体步骤包括：(a)准备材料：大蜡螟幼虫、胰蛋白、酵母粉、NaCl、琼脂粉、水、线虫液、安替福民，准备器材：培养皿、镊子、滤纸、超净工作台、灭菌锅、移液枪、枪头、酒精灯、三角瓶、筛网；用牛皮纸将镊子、枪头、培养皿、三角瓶、筛网包好后进行灭菌处理；(b)配制菌种培养基，灭菌处理后，倒入培养皿中；(c)培养皿中垫上滤纸，每个培养皿中放入10条大蜡螟幼虫，用牛皮纸包住培养皿，灭菌处理；(d)对灭菌后的大蜡螟虫体表面及虫体内部划平板法监测灭菌效果，配制线虫液，取线虫液1.5ml接种到灭菌后的大蜡螟幼虫的培养皿中，每天观察并记录大蜡螟体色变化；(e)接种后第八天，对大蜡螟虫体表面及虫体内部划平板法监测灭菌效果，将大蜡螟取出放到灭菌后的空三角瓶，加入安替福民溶液侵泡15分钟，用灭菌水洗净大蜡螟体表的安替福民；(f)获取线虫液并计数，取线虫液划平板法，检测线虫液是否有杂菌；若无杂菌，此线虫液为一级线虫种，将取得的一级种虫解剖，通过划平板法分离取得初生型杆菌。作为优选，所述(a)步骤中，灭菌处理为在高压灭菌锅中122℃灭菌60分钟。作为优选，所述(b)步骤中，菌种培养基，采用LB培养基，LB培养基组分为：蛋白胨1％，氯化钠0.5％，酵母0.5％，水98％；灭菌处理为122℃高压灭菌30分钟。作为优选，所述(c)步骤中，灭菌处理为在高压灭菌锅中122℃灭菌15分钟。作为优选，所述(d)步骤中，线虫液的配制浓度为10000IJS/1.5ml。作为优选，所述(d)、(e)、(f)步骤，均在超净工作台上操作。作为优选，所述(f)步骤中，获取线虫液的方法为，捣碎大蜡螟，侵泡45分钟，去上清液，将下层液用筛网过滤到另一三角瓶中，重复以上步骤3次得线虫液。本专利技术的有益效果：本专利技术通过大蜡螟活体培养方法解决了一级种虫多代繁殖退化的问题，通过大蜡螟活体培养，经表面消毒后得到的线虫一级种源，生产的线虫活力好、致病力高，降低生产成本，发展前景好，对昆虫病原线虫的规模化生产和对地下害虫的生物防治具有非常重要的意义。本专利技术的特征及优点将通过实施例进行详细说明。【具体实施方式】本专利技术一种昆虫病原线虫一级种源制备方法，具体步骤包括：步骤一、准备材料：大蜡螟幼虫、胰蛋白、酵母粉、NaCl、琼脂粉、水、线虫液、安替福民，准备器材：培养皿、镊子、滤纸、超净工作台、灭菌锅、移液枪、枪头、酒精灯、三角瓶、筛网；用牛皮纸将镊子、枪头、培养皿、三角瓶、筛网包好后进行灭菌处理；步骤二、配制菌种培养基，灭菌处理后，倒入培养皿中；步骤三、培养皿中垫上滤纸，每个培养皿中放入10条大蜡螟幼虫，用牛皮纸包住培养皿，灭菌处理；步骤四、对灭菌后的大蜡螟虫体表面及虫体内部划平板法监测灭菌效果，配制线虫液，取线虫液1.5ml接种到灭菌后的大蜡螟幼虫的培养皿中，每天观察并记录大蜡螟体色变化；步骤五、接种后第八天，对大蜡螟虫体表面及虫体内部划平板法监测灭菌效果，将大蜡螟取出放到灭菌后的空三角瓶，加入安替福民溶液侵泡15分钟，用灭菌水洗净大蜡螟体表的安替福民；步骤六、获取线虫液并计数，取线虫液划平板法，检测线虫液是否有杂菌；若无杂菌，此线虫液为一级线虫种，将取得的一级种虫解剖，通过划平板法分离取得初生型杆菌。所述(a)步骤中，灭菌处理为在高压灭菌锅中122℃灭菌60分钟。所述(b)步骤中，菌种培养基，采用LB培养基，LB培养基组分为：蛋白胨1％，氯化钠0.5％，酵母0.5％，水98％；灭菌处理为122℃高压灭菌30分钟。所述(c)步骤中，灭菌处理为在高压灭菌锅中122℃灭菌15分钟。所述(d)步骤中，线虫液的配制浓度为10000IJS/1.5ml。所述(d)、(e)、(f)步骤，均在超净工作台上操作。所述(f)步骤中，获取线虫液的方法为，捣碎大蜡螟，侵泡45分钟，去上清液，将下层液用筛网过滤到另一三角瓶中，重复以上步骤3次得线虫液。本专利技术通过大蜡螟活体培养方法解决了一级种虫多代繁殖退化的问题，通过大蜡螟活体培养，经表面消毒后得到的线虫一级种源，生产的线虫活力好、致病力高，降低生产成本，发展前景好，对昆虫病原线虫的规模化生产和对地下害虫的生物防治具有非常重要的意义。上述实施例是对本专利技术的说明，不是对本专利技术的限定，任何对本专利技术简单变换后的方案均属于本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种昆虫病原线虫一级种源制备方法，其特征在于：具体步骤包括：(a)准备材料：大蜡螟幼虫、胰蛋白、酵母粉、NaCl、琼脂粉、水、线虫液、安替福民，准备器材：培养皿、镊子、滤纸、超净工作台、灭菌锅、移液枪、枪头、酒精灯、三角瓶、筛网；用牛皮纸将镊子、枪头、培养皿、三角瓶、筛网包好后进行灭菌处理；(b)配制菌种培养基，灭菌处理后，倒入培养皿中；(c)培养皿中垫上滤纸，每个培养皿中放入10条大蜡螟幼虫，用牛皮纸包住培养皿，灭菌处理；(d)对灭菌后的大蜡螟虫体表面及虫体内部划平板法监测灭菌效果，配制线虫液，取线虫液1.5ml接种到灭菌后的大蜡螟幼虫的培养皿中，每天观察并记录大蜡螟体色变化；(e)接种后第八天，对大蜡螟虫体表面及虫体内部划平板法监测灭菌效果，将大蜡螟取出放到灭菌后的空三角瓶，加入安替福民溶液侵泡15分钟，用灭菌水洗净大蜡螟体表的安替福民；(f)获取线虫液并计数，取线虫液划平板法，检测线虫液是否有杂菌；若无杂菌，此线虫液为一级线虫种，将取得的一级种虫解剖，通过划平板法分离取得初生型杆菌。

【技术特征摘要】
1.一种昆虫病原线虫一级种源制备方法，其特征在于：具体步骤包括：(a)准备材料：大蜡螟幼虫、胰蛋白、酵母粉、NaCl、琼脂粉、水、线虫液、安替福民，准备器材：培养皿、镊子、滤纸、超净工作台、灭菌锅、移液枪、枪头、酒精灯、三角瓶、筛网；用牛皮纸将镊子、枪头、培养皿、三角瓶、筛网包好后进行灭菌处理；(b)配制菌种培养基，灭菌处理后，倒入培养皿中；(c)培养皿中垫上滤纸，每个培养皿中放入10条大蜡螟幼虫，用牛皮纸包住培养皿，灭菌处理；(d)对灭菌后的大蜡螟虫体表面及虫体内部划平板法监测灭菌效果，配制线虫液，取线虫液1.5ml接种到灭菌后的大蜡螟幼虫的培养皿中，每天观察并记录大蜡螟体色变化；(e)接种后第八天，对大蜡螟虫体表面及虫体内部划平板法监测灭菌效果，将大蜡螟取出放到灭菌后的空三角瓶，加入安替福民溶液侵泡15分钟，用灭菌水洗净大蜡螟体表的安替福民；(f)获取线虫液并计数，取线虫液划平板法，检测线虫液是否有杂菌；若无杂菌，此线虫液为一级线虫种，将取得的一级种虫解剖，通过划平板法分离取得初生型杆菌。2.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛锡良，张斌，夏博，李飞，
申请(专利权)人：浙江绿神天敌生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33