本发明专利技术公开了一种防治根结线虫的伴胞晶体蛋白组合物及其应用，其中伴胞晶体蛋白组合物包括苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白Cry1Ia和Cry2Ab，Cry1Ia的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，Cry2Ab的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术的防治根结线虫蛋白组合物具有低毒、生态环保，能延缓线虫抗药性的产生等优势，可应用于根结线虫病害防治。
Crystal protein composition for preventing and controlling root knot nematode and application thereof
The invention discloses a parasporal crystal protein composition and its application for prevention and control of root knot nematode, the parasporal crystal protein composition including Bacillus thuringiensis parasporal crystal protein Cry1Ia and Cry2Ab, the amino acid sequence of Cry1Ia SEQ ID NO:1 shows Cry2Ab amino acid sequence of SEQ ID NO:2 show. The method for preventing and controlling root knot nematode protein composition has the advantages of low toxicity, ecological environment protection, delaying the generation of drug resistance of nematodes, and the like.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物
，尤其涉及一种防作物根结线虫病的伴胞晶体蛋白组合物及其应用。
技术介绍
植物寄生线虫病是农作物的重要病害之一。全球每年由植物寄生线虫所造成的作物损失超过千亿美元(Chiwold，2003)，线虫病害已成为农业生产上的一个突出问题。其中仅根结线虫(Meloidogynespp.)每年造成的损失超过数百亿美元，特别是热带与亚热带地区根结线虫危害更重。由于根结线虫种类多，寄主范围广，防治难度大。目前农业生产上常采用化学杀线剂来防治作物根结线虫病。但现今市场上杀线虫剂的品种有限，大部分为高毒、高残留农药，长期单一地使用高毒、高残留的化学杀线虫剂，不仅对环境造成了严重的污染，也引发了农产品中农药残留超标、线虫抗药性日益突出等系列环境和社会问题。近年来，随着人们对农产品安全的日益关注，化学农药的使用越来越受到限制，因此，研发有效的杀线虫微生物以补充或替代化学杀线虫剂就显得日益迫切。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)是目前世界上应用最广泛、最成功的微生物杀虫剂，被广泛应用于农业、林业、贮藏以及卫生等领域的害虫防治。自从1961年Ciordia等首次发现Bt对牛肠道蛇形毛圆线虫(thichostrongyluscolubriformis)卵和幼虫有杀灭作用以来，Bt的杀线虫作用才逐渐引起人们的关注。1985年Bone等首次证实了Bt伴胞晶体蛋白(δ-内毒素)对线虫的作用活性，2003年Wei等研究了不同基因产生的伴胞晶体蛋白对几种自由生活线虫的毒性，从两个主要的Bt晶体蛋白亚家族中表达出了7种不同的晶体毒素蛋白，通过测试这些晶体毒素蛋白对自由生活的线虫毒性，证实了其中4种晶体毒素蛋白(Cry5B、Cry6A、Cryl4A、Cry21A)对多种线虫种类均有活性，所测试的线虫至少对一种晶体毒素蛋白敏感，从而明确提出Bt晶体毒素蛋白具有杀线虫能力(WeiJZ,2003)。目前发现的具有杀线虫作用的Bt伴胞晶体蛋白主要有Cry1、Cry5、Cry6、Cry12、Cry13、Cry14以及Cry21等几大类。有研究表明使用两种或多种不同类型的杀虫晶体蛋白进行复配，可以提高杀虫活性，扩大杀虫谱，有效延缓或克服害虫抗药性的产生。1985年，Wu和Chang等发现Bt以色列亚种(B.thuringiensissubsp.israelensis)中26kD与65、130kD蛋白组合均有增效作用。1996年Lee等发现Cry1Aa与Cry2Ab组合，增强了对舞毒蛾的作用活性。Vadim等(2003)测定了蛋白P20、Cyt1Aa、Cry4Aa以及Cry11Aa之间不同组合对登革热蚊子毒性，结果表明蛋白P20和Cyt1Aa对Cry4Aa及Cry11Aa都存在协同增效作用。Xue等(2005)研究了杀虫蛋白Cry1Aa与Cry1c组合物对甜菜夜蛾的毒性，表明两者以1∶1比例混合比单独的毒力有很大的提高。蔡吉林等(2013)报道了Cry1Ea和Cry9Aa蛋白以及Cry1Ai和Cry9Aa蛋白在1∶1混配时，对小菜蛾(Plutellaxylostella(Linnaeus))表现出了显著的增效作用。但还未见有关于Cry1Ia和Cry2AbBt蛋白组合物在植物线虫防治上的协同增效作用的相关研究报道。而发现新的杀线虫蛋白以及协同增效蛋白组合物在防治植物线虫病害上将具有重要意义，是保障农业可持续安全生产的重要手段。本申请人所在研究团队长期从事植物线虫生防菌株的筛选与开发利用研究工作，筛选获得了高毒力杀线虫Bt菌株YC-10，其对南方根结线虫等具有很好的毒杀作用(已获得国家专利技术专利，ZL201110261675.8)。随后对该菌株进行了全基因组测序，序列登录号为CP011349，从基因组序列信息中获得伴胞晶体蛋白cry基因序列，并对该菌株的cry基因进行了克隆与原核表达，获得了不同伴胞晶体蛋白。在对单个伴胞晶体蛋白进行杀线虫活性测试的基础上，对Bt伴胞晶体蛋白进行组合混配，研究其蛋白间的协同增效作用，以期获得对线虫作用效果好的Bt蛋白组合物。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种低毒、生态环保，能延缓根结线虫抗药性的产生等优势的防治作物根结线虫病害的蛋白组合物，还提供了该杀线虫蛋白组合物在防治作物根结线虫病害中的应用。为解决上述技术问题，提供了一种防治作物根结线虫病害的伴胞晶体蛋白组合物，包括苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白Cry1Ia和Cry2Ab，所述Cry1Ia的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示，所述Cry2Ab的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。上述的防治作物根结线虫病害的伴胞晶体蛋白组合物，优选的，所述Cry1Ia和Cry2Ab的质量比为1∶3～3∶1。进一步优选的，所述Cry1Ia和Cry2Ab的质量比为2∶1。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种上述的防治作物根结线虫病害的伴胞晶体蛋白组合物在作物根结线虫病害防治中的应用。上述的应用，优选的，所述防治根结线虫的伴胞晶体蛋白组合物的浓度为20.0mg/L～40.0mg/L。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：(1)本专利技术针对目前Bt蛋白在线虫防治应用上的不足，利用已有的BtCry蛋白资源，将其进行不同组合，以期获得具有较好杀线虫作用效果的Cry蛋白组合物，为杀线虫制剂的开发利用打下基础。本专利技术提供一组来自Bt菌株的蛋白组合物Cry1Ia和Cry2Ab，该组合物对南方根结线虫具有显著的协同增效作用，组合物比单个蛋白作用活性更强，防治效果得到显著提高，可以达到高效防治作物根结线虫病害的目的。同时组合物低毒、生态环保，能延缓根结线虫抗药性的产生等优势，可做为新型的生物农药。(2)本专利技术提供了该蛋白组合物中活性蛋白的有效组合比例，当Cry1Ia蛋白和Cry2Ab蛋白按照质量比为2∶1混合时，协同增效作用最显著，对南方根结线虫J2作用活性共毒系数达到了480。附图说明为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。图1为克隆表达Cry1Ia蛋白及纯化后的PAGE检测图(泳道1为蛋白Marker，泳道2～5分别为未经诱导的工程菌菌株抽提的蛋白，0.5MIPTG诱导工程菌菌株抽提蛋白，转空载体的工程菌菌株抽提的蛋白，亲和层析纯化并脱盐浓缩后的Cry1Ia蛋白)。图2为克隆表达Cry2Ab蛋白及纯化后的PAGE检测图(泳道1为蛋白Marker，泳道2～5分别为0.5MIPTG诱导表达蛋白，未经诱导工程菌菌株抽提蛋白、转空载体的工程菌菌株抽提的蛋白、亲和层析纯化并脱盐浓缩后的Cry2Ab蛋白)。图3为Cry1Ia与Cry2Ab蛋白组合物处理南方根结线虫J2室内生测图(a为对照，b为20mg/L蛋白组合物处理72h)。具体实施方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本专利技术作进一步描述，但并不因此而限制本专利技术的保护范围。实施例以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。实施例1：一种本专利技术的Cry1Ia蛋白，其序列为：MKLKNQDKHQSFSSNAKVDKISTDSLKNETDIELQNINHEDCLKMSEYENVEPFVS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种防治作物根结线虫病的伴胞晶体蛋白组合物，其特征在于，包括苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白Cry1Ia和Cry2Ab，所述Cry1Ia的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，所述Cry2Ab的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1.一种防治作物根结线虫病的伴胞晶体蛋白组合物，其特征在于，包括苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白Cry1Ia和Cry2Ab，所述Cry1Ia的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示，所述Cry2Ab的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。2.根据权利要求1所述的伴胞晶体蛋白组合物，其特征在于，所述Cry1Ia和Cry2Ab的质量比...
【专利技术属性】
技术研发人员：成飞雪，刘勇，张德咏，宋志强，
申请(专利权)人：湖南省植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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