一种生物转化类固醇类化合物获取羟基化化合物的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用细胞色素P450酶的重组菌生物转化类固醇类化合物获得羟基化化合物方法。该方法首先制备共表达重组大肠杆菌，然后对该重组大肠杆菌进行前培养和扩大培养，收集菌体后用于对类固醇类化合物进行生物转化；本发明专利技术采用细胞色素P450酶CYP105D7重组大肠杆菌生物转化类固醇类化合物，生成2β位和16β位羟基化化合物；经过定点突变，构建了更高效的重组突变株，转化率比野生型提高了近20倍。

A Method for Bioconversion of Steroids to Hydroxyl Compounds

【技术实现步骤摘要】
一种生物转化类固醇类化合物获取羟基化化合物的方法
本专利技术属于生物
，特别地，涉及一种利用重组大肠杆菌生物转化类固醇类化合物(steroid)获得羟基化化合物的方法。
技术介绍
甾体药物在医药上占有重要地位，除了薯蓣皂苷元天然化合物在甾体药物的广泛应用外，一些甾醇如胆固醇、谷甾醇和菜籽甾醇等现在也被认为是具有巨大潜能的甾体激素类药物的起始原料。甾体激素药物对机体起着非常重要的调节作用，被誉为“生命的钥匙”。甾体化合物又称类固醇化合物，是环戊烷多氢菲类化合物的总称，普遍存在于动植物组织内。甾族化合物都含有一个由四个环组成的基本骨架，即由三个六元环和一个五元环稠合的碳结构，这个骨架是甾族化合物的母核，即环戊烷多氢菲。四个环用字母A、B、C和D表示，并将17个碳原子按特定顺序编号。大多数甾体化合物在环戊烷多氢菲的母核上还有三个侧链,它们分别连在C-10,C-13和C-17的碳原子上。许多甾体化合物都具有很强的生理活性，如皮质酮、氢化可的松、睾酮、雄酮、孕酮和雌二酮等，对机体起着非常重要的调节作用，如肾上腺皮质激素能治疗或缓解胶原性疾病、过敏性休克等难治或危险的疾病，也是治疗阿狄森氏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物转化类固醇类化合物获得羟基化化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备共表达重组大肠杆菌：用定点突变试剂盒对阿维链霉菌MA4680的编码CYP105D7的sav7469基因在R70A/R190A位置进行双突变以获得双突变基因序列sav7469R70A/R190A，用Nde I和Spe I酶切获得双突变基因序列和载体pT7NS‑camAB，并进行连接获得重组载体pET11::sav7469R70A/R190A::camA‑camB，将重组载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，最终获得共表达重组大肠杆菌；所述阿维链霉菌MA4680的编码CYP105D7的sav7469R70A...

【技术特征摘要】
1.一种生物转化类固醇类化合物获得羟基化化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备共表达重组大肠杆菌：用定点突变试剂盒对阿维链霉菌MA4680的编码CYP105D7的sav7469基因在R70A/R190A位置进行双突变以获得双突变基因序列sav7469R70A/R190A，用NdeI和SpeI酶切获得双突变基因序列和载体pT7NS-camAB，并进行连接获得重组载体pET11::sav7469R70A/R190A::camA-camB，将重组载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，最终获得共表达重组大肠杆菌；所述阿维链霉菌MA4680的编码CYP105D7的sav7469R70A/R190A双突变基因序列如SEQIDNO.2所示，载体pT7NS-camAB的基因序列如SEQIDNO.4所示，重组载体pET11::sav7469R70A/R190A::camA-camB的基因序列如SEQIDNO.5所示；(2)重组大肠杆菌的前培养和扩大培养：将重组大肠杆菌加入LB培养基中，在pH为7.4-7.6范围内，温度为37℃、转速为200rpm条件下培养18小时，得重组大肠杆菌的种子液；将重组大肠杆菌的种子液接种到M9培养基中进行扩大培养、发酵；种子液和M9培养基的体积比为1:100，接种后，重组的大肠杆菌继续在37℃、培养至菌液OD600值达到0.6～0.8，然后加入IPTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：许莲花，马炳炳，王倩文，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33