一种大幅度提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法技术

本发明专利技术公开了一种大幅度提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法，优选了大肠杆菌BL21(DE3)，利用基因编辑，无痕敲除高表达大肠杆菌BL21(DE3)上的Rnc基因，匹配优选的单T7启动子RNAi表达载体，大量表达dsRNA。本发明专利技术通过对大肠杆菌BL21(DE3)进行改造，使其丧失降解外源dsRNA的能力，再匹配优选的pET系列干扰载体，在IPTG的作用下大量表达dsRNA。利用大肠杆菌高效、大批量、低成本表达dsRNA，使得田间大量使用dsRNA进行害虫防治成为了可能，同时为靶向害虫关键基因的各种RNAi制剂的研发建立了低成本的物质基础，将推动以RNAi为核心技术的害虫防治新技术的发展。

A Method for Improving the Expression Rate of dsRNA in Escherichia coli

【技术实现步骤摘要】
一种大幅度提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种大幅度提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法。
技术介绍
CRISPR/Cas9(Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedprotein9)是近期发现的一种新型的基因组定点编辑技术。CRISPR/Cas9从对真菌和古菌宿主免疫防御研究的基础上发展而来，属于CRISPR/Cas蛋白家族中的Ⅱ型，该系统结构简单，仅由Cas9蛋白(CRISPR-associated蛋白)、tracrRNA(trans-activatingRNA)、crRNA(CRISPR-derivedRNA)及RNaseⅢ4种成分组成。crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合，形成双链RNA。这一tracrRNA:crRNA二元复合体指导Cas9蛋白识别DNA的PAM序列，随后crRNA与互补链结合形成RNA：DNA杂合链，另一条非互补DNA链游离，最后由Cas9蛋白的RuvC和HNH位点分别切割互补链和非互补链进而引入DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大幅度提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法，其特征在于，包括步骤：(1)对大肠杆菌菌株进行改造，制造Rnc基因缺失型菌株；(2)选择表达载体与目的基因片段构建重组表达载体；(3)将该重组表达载体转入步骤(1)改造后的受体菌中，在体外诱导表达产生dsRNA。

【技术特征摘要】
1.一种大幅度提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法，其特征在于，包括步骤：(1)对大肠杆菌菌株进行改造，制造Rnc基因缺失型菌株；(2)选择表达载体与目的基因片段构建重组表达载体；(3)将该重组表达载体转入步骤(1)改造后的受体菌中，在体外诱导表达产生dsRNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的方法，具体包括以下步骤：S1、构建能够表达Cas9蛋白的pCas9载体，针对大肠杆菌rnc基因设计sgRNA，构建能够表达该sgRNA和red同源重组系统的pRNA-Rnc重组质粒；S2、针对pCas9载体的复制子序列设计sgRNA，构建能够表达该sgRNA和λ-Red同源重组系统的pRNA-rep重组质粒；S3、克隆大肠杆菌基因组中Rnc基因两侧序列，并利用融合PCR方法构建带有Rnc基因左右同源臂的打靶片段；S4、将pCas9和pRNA-Rnc载体共转入大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于对应抗生素抗性的LB平板并进行过夜培养；S5、次日挑单菌于含有适应抗性的LB液体培养基中继续培养，加入诱导剂使red同源重组系统得到表达，制备感受态，电转打靶片段，孵育后涂布于特定抗性的LB平板，过夜培养；S6、挑单菌至适应抗性的液体培养基中继续培养，PCR鉴定，将阳性克隆于LB中培养过夜；S7、制备化转感受态，转入pRNA-rep质粒，于适应抗性的LB中培养过夜；S8、在特定条件下消除pCas9和pRNA-rep。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤S1中，pRNA-Rnc为温敏型质粒，培养条件不超过30℃，pCas9在PTET启动子和tetR组成型表达的控制下表达，pRNA-Rnc具有在PTET启动子控制下表达的sgRNA和在阿拉伯糖可诱导启动子ParaB控制下组成的λ-Red系统的三个基因。4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述pRNA-rep为S...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈杰，马中正，王丹，张俊争，闫硕，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11