【技术实现步骤摘要】
一种去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法
本专利技术涉及一种去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法，属于肝细胞分离与纯化
技术介绍
原代肝细胞是指从肝组织取出后立即培养的肝细胞，可广泛用于基础研究与药物研发，包括肝脏研究、肝炎病毒研究，药物代谢及毒性研究。然而，分离原代肝细胞时，细胞活力受多种条件影响，包括肝组织新鲜程度、灌注时间、灌注溶液组成等，存在较大的批次差异。现有技术分离的原代肝细胞的细胞活力为45％-95％，这严重影响了基于原代肝细胞的实验研究及药物研发。目前，去除死肝细胞的常规方法有两种，具体如下：第一种方法，低速离心法。该方法的原理是基于活肝细胞与死细胞、细胞碎片的质量与密度不同，通过低速离心(约离心加速度50g)，活肝细胞以沉淀形式与上清中的细胞碎片和死细胞分离开。上述方法是肝细胞分离过程中常规的步骤，可以去除一部分的细胞渣和少量的死细胞，但是此方法去除效果有限而造成肝细胞活力偏低。第二种方法，利用离心介质——Percoll或Ficoll400，将细胞悬液加到Percoll或Ficoll400之上，通过离心力，将活细胞沉...
【技术保护点】
1.一种去除死肝细胞的分离液，其特征在于，是在William’s E培养基中添加以下成分：0.1％v/v‑1.5％v/v的ITS通用型培养添加剂、1.5mmol/L‑2.5mmol/L的L‑谷氨酰胺、1μg/L‑20μg/L的表皮生长因子、15mg/L‑20mg/L的氢化可的松、35μg/L‑45μg/L的地塞米松、0.5％v/v‑1％v/v的青链霉素、1％v/v‑10％v/v的胎牛血清和0.25g/mL‑0.5g/mL的Nycodenz。
【技术特征摘要】
1.一种去除死肝细胞的分离液，其特征在于，是在William’sE培养基中添加以下成分：0.1％v/v-1.5％v/v的ITS通用型培养添加剂、1.5mmol/L-2.5mmol/L的L-谷氨酰胺、1μg/L-20μg/L的表皮生长因子、15mg/L-20mg/L的氢化可的松、35μg/L-45μg/L的地塞米松、0.5％v/v-1％v/v的青链霉素、1％v/v-10％v/v的胎牛血清和0.25g/mL-0.5g/mL的Nycodenz。2.根据权利要求1所述的去除死肝细胞的分离液，其特征在于，所述去除死肝细胞的分离液，是在William’sE培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素、5％v/v的胎牛血清和0.3g/mL的Nycodenz。3.根据权利要求1或2所述的去除死肝细胞的分离液，其特征在于，所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素。4.根据权利要求1所述的去除死肝细胞的分离液，其特征在于，所述1.5mmol/L-2.5mmol/L的L-谷氨酰胺由1.5mmol/L-2.5mmol/L的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽替代。5.根据权利要求1所述的去除死肝细胞的分离液，其特征在于，所述1％v/v-10％v/v的胎牛血清由1％v/v-10％v/v的人血白蛋白替代。6.一种利用权利要求1-5任一项所述的去除死肝细胞的分离液去除死肝细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞取新鲜的肝组织，用灌注溶液I灌注10min-30min，直至冲洗干净肝组织中的血液，然后再用37℃预热的灌注溶液II灌注15min-30min，直至肝组织失去弹性，得到消化好的肝组织；步骤2：消化终止与细胞分散将步骤1得到的消化好的肝组织转移到含有常温灌注溶液II的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液并过细胞筛，得到单细胞悬液并第一次离心；步骤3：细胞洗液清洗将步骤2得到的第一次离心后的上清去掉，加入预冷的细胞洗液，巴氏吸管重悬细胞，第二次离心，重复本步骤2次，得到清洗好的单细胞悬液；步骤4：细胞活力的检测取步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4％m/v台酚蓝染色液以体积比1:...
【专利技术属性】
技术研发人员：周明，黄梓刚，刘丹，
申请(专利权)人：立沃生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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