【技术实现步骤摘要】
一种人脐静脉内皮原代分离培养方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种人脐静脉内皮原代分离培养方法。
技术介绍
内皮细胞是覆盖于血管内表面的一种单层扁平磷状上皮细胞，位于血液和血管壁或组织的之间。过去学者们普遍认为内皮细胞仅构成一种简单的机械屏障，然而随着科学的进展，人们对内皮细胞的了解不断加深，内皮细胞在维持机体稳态中有着具足轻重的作用。在机体中，内皮细胞可以释放多种活性介质，调节血管紧张度、介导炎症反应、参与血管新生、血栓形成等多种病理生理过程。内皮细胞已经成为生命科学领域重要的研究工具，广泛应用于蛋白质组学、基因组学、遗传学、药物筛选、药物代谢、毒理研究、高血压治疗与诊断等众多领域。在众多内皮细胞中，人脐静脉内皮细胞(Humanumbilicalendothelialcell,HUVEC)具有得天独厚的优势：标本易采集且对患者无任何伤害、脐静脉血管管径粗易操作，具有干细胞潜能传代能力强等。目前已经创建了多种永生的脐静脉内皮细胞系，如HUV-EC-C,HUVEC-CS，t-HUVEC，T/HUVEC，HUVEC/TERT2和PUMC-HUVEC-T1等供研...
【技术保护点】
1.一种人脐静脉内皮原代分离培养方法，其特征在于，采集术后脐带，然后加入胶原酶分离提取脐静脉内皮细胞制成单细胞悬液，培养得到P0代细胞，使用基于M199培养基的完全培养基将P0代细胞培养至P2代细胞；采用胰蛋白酶对P2代细胞进行消化，接种于T75培养瓶中，采用基于M199培养基的完全培养基培养，待细胞融合度为80～90％时，得到扩增培养后的人脐静脉内皮细胞P3代细胞。
【技术特征摘要】
1.一种人脐静脉内皮原代分离培养方法，其特征在于，采集术后脐带，然后加入胶原酶分离提取脐静脉内皮细胞制成单细胞悬液，培养得到P0代细胞，使用基于M199培养基的完全培养基将P0代细胞培养至P2代细胞；采用胰蛋白酶对P2代细胞进行消化，接种于T75培养瓶中，采用基于M199培养基的完全培养基培养，待细胞融合度为80～90％时，得到扩增培养后的人脐静脉内皮细胞P3代细胞。2.根据权利要求1所述的人脐静脉内皮原代分离培养方法，其特征在于，采集术后脐带后，用PBS溶液冲洗脐静脉管腔，然后灌注I型胶原酶37℃消化，分离提取脐静脉内皮细胞制成单细胞悬液，在T25培养瓶中使用200mLM199培养基培养至细胞融合度为80～90％时，得到P0代细胞。3.根据权利要求2所述的人脐静脉内皮原代分离培养方法，其特征在于，I型胶原酶加入量为每10～15cm长的脐带组织灌注0.1％I型胶原酶3～8mL。4.根据权利要求3所述的人脐静脉内皮原代分离培养方法，其特征在于，I型胶原酶消化时间8～15min。5.根据权利要求2所述的人脐静脉内皮原代分离培养方法，其特征在于，PBS溶液的体积为20～100mL。6.根据权利要求2所述的人脐静脉内皮原代分离培养方法，其特征在于，培养温度为36.5～37.5℃，CO2浓度为4.5～5.5％。7.根据权利要求1所述的人脐静脉内皮原代分离培养方法，其特征在于，胰蛋白酶的浓度为0.025％～0.125％。8.根据权利要求1所述的人脐静脉内皮原代分离培养方法，其特征在于，胰蛋白酶的浓度为0.05％。9.根据权利要求1或2所述的人脐静脉内皮原代分离培养方法，其特征在于，完全培养基为80mLM199培养基、20mLFBS溶液、1mL青链霉素混合溶液、1000U肝素钠注射液和2mLHEPES缓冲液。10.根据权利要求9所述的人脐静脉内皮原代分离培养方法，其特征在于，M199培养基组成包括：浓度25.0mg/L的丙氨酸0.28mM；浓度70.0mg/L的精氨酸0.33mM；浓度30mg/L的天冬氨酸0.22mM；浓度0.1mg/L的半胱氨酸5.68mM；浓度15mg/L的甲硫氨酸0.1mM；浓度25.0mg/L的苯丙氨酸0.15mM；浓度40mg/L的脯氨酸0.34mM；浓度25.0mg/L的丝氨酸0.23mM；...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘进军，王政，孙雨瑶，赵弓枭，李雨蓓，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61
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