本发明专利技术属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种BHK‑21细胞系BHK‑21‑BP‑2克隆株及其在全悬浮细胞培养中的应用。本发明专利技术提供BHK‑21‑BP‑2克隆株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17588。该克隆株在进行全悬浮细胞培养接种伪狂犬病毒后，细胞病变快，产生病毒毒价高，24h～48h即可收毒；收毒时只需离心收获上清，不需反复冻融，生产工艺简单；生产的病毒抗原液的总蛋白含量低，获得的有效病毒抗原完整性高，抗原质量好，具有优异的免疫原性和安全性；制备的伪狂犬病毒疫苗具有稳定性高、批间差异小、免疫效果好、安全性高的优势。
A Clone of BHK-21 Cell Line BHK-21-BP-2 and Its Application in Full Suspension Cell Culture
【技术实现步骤摘要】
一种BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株及其在全悬浮细胞培养中的应用
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株及其在全悬浮细胞培养中的应用。
技术介绍
伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的多种家畜和野生动物的急性传染病。猪是该病毒的最主要宿主，新生仔猪及15日龄以内的仔猪表现明显的神经症状，死亡率达100％；育肥猪常呈隐形感染，成年猪感染后多耐过，但长期排毒，表现为流产、死胎、木乃伊胎等。近年来，由于伪狂犬病毒发生新的变异株的流行，导致许多伪狂犬疫苗免疫猪场发生伪狂犬病。国内生产伪狂犬病疫苗的方法主要采用转瓶培养工艺，但由于该方法存在疫苗批间差异大、生产效率低、占用场地多等缺点，已经越来越不适合当前疫苗大规模生产的要求。近几年，针对伪狂犬病毒变异株的灭活苗的新产品研发成为新的研究热点。此外，随着悬浮培养生产技术的发展，利用悬浮培养生产病毒抗原的方法可进一步降低生产成本，提高产品品质。目前，在伪狂犬病毒大规模培养方面，有利用微载体生物反应器培养伪狂犬病病毒的报道，也有利用细胞全悬浮培养伪狂犬病毒抗原的报道，其中，不依赖微载体进行细胞的全悬浮培养比微载体悬浮培养的操作更简便。专利申请CN104740627利用细胞悬浮工艺规模化生产伪狂犬弱毒活疫苗；专利申请CN105727277A利用生物反应器制备猪伪狂犬病毒疫苗。采用全悬浮细胞培养病毒时，用于生产病毒的细胞的性能以及细胞与病毒之间的适应性极大地影响病毒的产量、抗原的完整性等抗原质量，进而影响病毒制备疫苗的免疫效果和安全性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种适用于全悬浮细胞培养、高效制备高质量病毒的BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株，以及利用该克隆株进行全悬浮细胞培养制备病毒抗原的方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17588。本专利技术提供的BHK-21-BP-2克隆株为对BHK-21细胞进行人工驯化筛选获得的能够进行全悬浮培养的细胞株。乳仓鼠肾细胞BHK-21BHK-21-BP-2克隆株(以下简称BHK-21-BP-2克隆株)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.17588，建议的分类命名为乳仓鼠肾细胞BHK-21。BHK-21-BP-2克隆株能够在培养瓶或生物反应器中不依赖于任何载体进行全悬浮培养，其适宜的最佳培养条件如下：36.5±0.5℃，pH7.2±0.1，溶氧30％～60％。本专利技术进一步提供含有所述BHK-21-BP-2克隆株的产品。所述产品包括但不限于含有BHK-21-BP-2克隆株的试剂。所述试剂除含有BHK-21-BP-2克隆株外，还可含有其它细胞株或本领域允许的辅料。本专利技术经实验证实，BHK-21-BP-2克隆株能够在接种病毒后较短时间内产生较高的毒价，并且制备的病毒抗原液的总蛋白含量较低，含有有效病毒抗原的比例高，病毒抗原的完整性高，具有良好的免疫原性和安全性。基于BHK-21-BP-2克隆株的上述性能，本专利技术提供所述BHK-21-BP-2克隆株在全悬浮培养制备病毒中的应用。作为优选，所述病毒为BHK-21细胞敏感的动物病毒。进一步优选地，所述病毒为伪狂犬病毒。具体地，所述应用为将所述BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮培养基中进行培养，接种病毒，继续培养，获得病毒液。本专利技术经实验验证，BHK-21-BP-2克隆株尤其适用于伪狂犬病毒的生产，BHK-21-BP-2全悬浮细胞在接种伪狂犬病毒后，细胞病变快，产生病毒毒价高，24h～48h即可收毒；收毒时只需离心收获上清，不需反复冻融，生产工艺简单；生产的伪狂犬病毒抗原液的总蛋白含量低，获得的有效病毒抗原完整性高，抗原质量好，具有优异的免疫原性和安全性。本专利技术还提供一种全悬浮细胞培养制备伪狂犬病毒的方法，具体为：将所述BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮培养基中培养，接种伪狂犬病毒，继续培养，获得伪狂犬病毒。具体地，所述全悬浮细胞培养制备伪狂犬病毒的方法包括如下步骤：(1)BHK-21-BP-2克隆株培养：将所述BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮培养基中进行培养；(2)接种伪狂犬病毒：当所述BHK-21-BP-2克隆株的细胞密度达到4×106～6×106cells/ml时，接种伪狂犬病毒；(3)伪狂犬病毒培养：继续培养接种伪狂犬病毒的BHK-21-BP-2克隆株，获得伪狂犬病毒液。作为优选，上述步骤(2)中，所述伪狂犬病毒的接种量为0.01～1MOI；更优选为0.1～1MOI。作为优选，上述步骤(1)中，所述BHK-21-BP-2克隆株培养的条件如下：温度36.5±0.5℃，pH7.2±0.1，溶氧30％～60％，搅拌速度60rpm～150rpm。作为优选，上述步骤(3)中，所述伪狂犬病毒培养的条件如下：温度36.5±0.5℃，pH7.2±0.1，溶氧50％～60％，搅拌速度80rpm～120rpm。上述搅拌速度可随细胞密度不同进行调整。作为优选，上述步骤(1)中，BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮细胞培养基后的初始细胞浓度为0.4～0.8×106cells/ml。作为优选，上述步骤(3)中，监测培养过程中的细胞的病变情况，当细胞病变达到60％～80％时，停止培养，收获病毒液。上述制备得到的病毒液可经灭活后制备为灭活抗原，用于伪狂犬病毒灭活疫苗的制备。作为优选，上述步骤(2)中，用于接种BHK-21-BP-2克隆株的伪狂犬病毒的种毒液的制备方法包括如下步骤：(1)将含1％(v/v)伪狂犬病毒种毒的病毒液接种于铺满单层的BHK-21贴壁细胞，孵育1h，弃去病毒液；(2)补充适当体积的含2％(v/v)血清的DMEM维持液，37℃培养，当细胞病变达到60％～80％时收获病毒液，-80℃反复冻融三次，取样检测病毒滴度，当0.1mL病毒含量≥107.0TCID50时保存病毒液，用于接种。本专利技术中，伪狂犬病毒可以为任意现有技术中的伪狂犬病毒毒株。作为本专利技术的一种实施方式，所述伪狂犬病毒为ZY-2014株(潘文，马良，张贺楠，邵葳，李晓冉，黄书林，猪伪狂犬病病毒ZY-2014株的分离与鉴定，中国兽医杂志，2016(05):1-6.)。本专利技术所述的无血清全悬浮培养基可为适于BHK-21全悬浮细胞生长的不含血清的天然或合成培养基。作为优选，所述无血清全悬浮培养基包括BHK201培养基、BS-SFMV培养基、CDBHK-21培养基、VM12-SFM培养基、BHK-LSM培养基中的任意一种或多种。上述培养基均为市售可得的商品化培养基：BHK201(壹生科深圳有限公司，产品代码：L10501)、BS-SFMV培养基(沃美生物技术有限公司，商品编号BSS20314-2)；CDBHK-21培养基(gibco公司，商品编号为：A16277-03)、VM12(SFM)(健顺生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种BHK‑21细胞系BHK‑21‑BP‑2克隆株，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17588。
【技术特征摘要】
1.一种BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17588。2.含有权利要求1所述BHK-21-BP-2克隆株的产品。3.权利要求1所述BHK-21-BP-2克隆株或权利要求2所述产品在全悬浮培养制备病毒中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒为BHK-21细胞敏感的动物病毒；优选为伪狂犬病毒。5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，将所述BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮培养基中进行培养，接种病毒，继续培养，获得病毒液。6.一种全悬浮细胞培养制备伪狂犬病毒的方法，其特征在于，将权利要求1所述BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮培养基中进行培养，接种伪狂犬病毒，继续培养，获得伪狂犬病毒。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)BHK-21-BP-2克隆株培养：将所述BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘文，黄书林，杨君敬，潘春刚，申咏红，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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