细胞培养基、试剂盒及细胞培养方法技术

本发明专利技术提供了一种细胞培养基，所述细胞培养基由基础培养基、营养源、通路抑制成分、抗氧化成分、糖皮质激素、激活成分和促分化成分组成。所述基础培养基为DMEM/12，所述通路抑制成分中的转化生长因子‑β信号抑制剂和γ‑分泌酶抑制剂用于促进肝向分化，再配合所述糖皮质激素、由腺苷酸环化酶激活剂组成的所述激活成分以及由FH1(BRD‑K4477)、FPH1(BRD‑6125)或FPH2(BRD‑9424)组成的促分化成分，共同取代现有技术中的二甲基亚砜来进一步促进肝前体细胞的成熟分化，避免了由于二甲基亚砜的毒性容易引起细胞凋亡的问题，且有利于缩短细胞成熟的时间。本发明专利技术还提供了包括所述细胞培养基的试剂盒，以及应用所述试剂盒进行的细胞培养方法。

Cell Culture Medium, Kit and Cell Culture Method

【技术实现步骤摘要】
细胞培养基、试剂盒及细胞培养方法
本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及细胞培养基、试剂盒及细胞培养方法。
技术介绍
传统临床上治疗肝癌或肝硬化等恶性肝脏病变的主要手段是肝移植，但是由于肝供体缺乏、手术风险大、费用高以及容易发生免疫排斥等负面因素制约了肝移植手术技术的发展。近年来，以肝细胞移植以及生物人工肝为代表的肝细胞替代治疗，成为终末期肝病治疗研究的热点。肝前体细胞(HepaticProgenitorCells，HPCs)是一类具有自我更新且增殖能力较强，并具有多向分化潜能的干细胞群，其表型特征接近肝细胞，能够直接参与肝脏的生长和发育，是肝细胞移植、细胞再生、研究病毒性肝炎发病机理以及抗病毒药物筛选研究方面的理想细胞来源。其中的人肝癌细胞系(HepaRG)是高度增殖的祖细胞系，具有同时分化成胆管细胞样细胞和肝细胞样细胞的潜力。而原代肝细胞来源的肝前体样细胞(Hepatocyte-derivedliverprogenitor-likecells，HepLPCs)在体外极易实现肝向分化，转变回功能性肝细胞。现有技术中，例如2002年发表在ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica(美国科学院院报)第99卷的“InfectionofahumanhepatomacelllinebyhepatitisBvirus”，采用含有较高浓度二甲基亚砜(DimethylSulfoxide，DMSO)的培养基来诱导HepaRG的分化。然而，DMSO具有一定的毒性，容易引起细胞的凋亡，且分化时间至少长达28天，限制了肝前体细胞分化成熟技术的应用推广。因此，有必要开发一种新型的细胞培养基以避免现有技术中存在的上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种细胞培养基，具有所述细胞培养基的试剂盒以及利用所述试剂盒进行的细胞培养方法，以促进不同类型肝前体细胞的分化和成熟，避免现有技术中由于使用DMSO诱导细胞分化而容易产生细胞凋亡的问题，同时缩短细胞分化成熟的时间，以利于肝前体细胞分化成熟技术的应用推广。为实现上述目的，本专利技术的所述细胞培养基，由基础培养基、营养源、通路抑制成分、抗氧化成分、糖皮质激素、激活成分和促分化成分组成；所述基础培养基为DMEM/12培养基，所述营养源包括无血清细胞培养添加剂，所述通路抑制成分由转化生长因子-β信号抑制剂和γ-分泌酶抑制剂组成，所述激活成分为腺苷酸环化酶激活剂，以用于激活蛋白激酶A，所述抗氧化成分包括氮乙酰半胱氨酸，所述促分化成分为FH1(BRD-K4477)、FPH1(BRD-6125)或FPH2(BRD-9424)；所述营养源的体积占所述基础培养基体积的1％-2％；每1000克所述基础组合培养基中，所述通路抑制成分的质量为7×10-4克-3×10-2克，所述抗氧化成分的质量为3.5×10-4克-1.1克，所述糖皮质激素的质量为2.3×10-3克-5.8×10-2克，所述激活成分的质量为8.2×10-4克-2.1×10-2克，所述促分化成分的质量为1.1×10-3克-0.15克。本专利技术所述细胞培养基的有益效果在于：所述细胞培养基中的所述无血清细胞培养添加剂提高了所述细胞培养基对不同类型的肝前体细胞的普适性；由所述转化生长因子-β信号抑制剂和所述γ-分泌酶抑制剂来阻断缺刻(Notch)信号的传递通路以及转化生长因子-β(TGF-β)信号的传递通路，以促进肝向分化，再配合所述糖皮质激素、所述腺苷酸环化酶激活剂以及由FH1(BRD-K4477)、FPH1(BRD-6125)或FPH2(BRD-9424)组成的所述促分化成分，共同取代现有技术中的二甲基亚砜来进一步促进肝前体细胞的成熟分化，避免了由于二甲基亚砜的毒性容易引起细胞凋亡的问题，且通过调节所述细胞培养基中各成分的配比，有利于在后续的细胞培养过程中，缩短细胞成熟的时间。优选的，所述无血清细胞培养添加剂为N2添加剂或胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂。其有益效果在于：有利于神经元细胞的体外培养。进一步优选的，所述胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比为25％-50％。进一步优选的，所述N2添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比为25％-50％。优选的，所述营养源还具有B27添加剂，所述B27添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比不大于100％。进一步优选的，所述B27添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比为50％-75％。优选的，所述转化生长因子-β信号抑制剂与所述γ-分泌酶抑制剂的质量比为3:1-5:1。其有益效果在于：有利于进一步促进肝向分化，提高得到的肝细胞样细胞的功能。进一步优选的，所述转化生长因子-β信号抑制剂为SB431542或A83-01，所述γ-分泌酶抑制剂为DATP、YO-01027、CompoundE或LY-411575。优选的，所述腺苷酸环化酶激活剂为佛司可林或环磷酸腺苷，所述糖皮质激素为地塞米松或氢化可的松，所述抗氧化成分还具有L-抗坏血酸、维生素E、类胡萝卜素或抗氧化酶。本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括增殖培养基以及所述细胞培养基，所述增殖培养基为William'sE培养基或TEM培养基。本专利技术的所述试剂盒的有益效果在于：所述试剂盒中具有的所述细胞培养基，由于所述细胞培养基不具有DMSO，所述无血清细胞培养添加剂提高了所述细胞培养基对不同类型的肝前体细胞的普适性；由所述转化生长因子-β信号抑制剂和所述γ-分泌酶抑制剂来阻断缺刻(Notch)信号的传递通路以及转化生长因子-β(TGF-β)信号的传递通路以促进肝向分化，配合所述糖皮质激素、所述腺苷酸环化酶激活剂以及由FH1(BRD-K4477)、FPH1(BRD-6125)或FPH2(BRD-9424)组成的所述促分化成分，共同取代现有技术中的二甲基亚砜来进一步促进肝前体细胞的成熟分化，一方面避免了由于二甲基亚砜的毒性容易引起细胞凋亡的问题，另一方面通过调节所述细胞培养基中各成分的配比，有利于所述试剂盒应用于细胞过程中，缩短细胞成熟的时间。优选的，所述试剂盒还具有包被液，所述包被液由DMEM/12培养基和细胞外基质组成。其有益效果在于：有利于后续细胞培养过程中促进细胞的贴壁效果。本专利技术还提供了利用所述试剂盒进行的细胞培养方法，包括：S1：将所述增殖培养基以及待培养细胞悬液以2:1-4:1的体积比混合，在150倍–200倍的重力加速度下离心5-10分钟，去除上清液以得到待培养细胞沉淀液，用所述增值培养基对所述待培养细胞沉淀液进行重悬处理后得到待培养细胞重悬液；S2：将所述待培养细胞重悬液加入到所述培养位中，以使所述培养位的每平方厘米的培养面积上具有1×105-2×106个待培养细胞，对所述待培养细胞进行扩增处理，以得到扩增细胞；S3：向所述扩增细胞中加入所述细胞培养基以启动分化培养，每24小时-72小时用新的所述细胞培养基进行置换处理以促进分化过程，所述分化培养的时间为6-14天。本专利技术所述细胞培养方法的有益效果在于：由于所述试剂盒中具有不含DMSO的所述细胞培养基，所述无血清细胞培养添加剂提高了所述细胞培养基对不同类型的肝前本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞培养基，用于促进肝前体细胞的分化和成熟，其特征在于，所述细胞培养基由基础培养基、营养源、通路抑制成分、抗氧化成分、糖皮质激素、激活成分和促分化成分组成；所述基础培养基为DMEM/12培养基，所述营养源包括无血清细胞培养添加剂，所述通路抑制成分由转化生长因子‑β信号抑制剂和γ‑分泌酶抑制剂组成，所述激活成分为腺苷酸环化酶激活剂，以用于激活蛋白激酶A，所述抗氧化成分包括氮乙酰半胱氨酸，所述促分化成分为FH1(BRD‑K4477)、FPH1(BRD‑6125)或FPH2(BRD‑9424)；所述营养源的体积占所述基础培养基体积的1％‑2％；每1000克所述基础培养基中，所述通路抑制成分的质量为7×10

【技术特征摘要】
1.一种细胞培养基，用于促进肝前体细胞的分化和成熟，其特征在于，所述细胞培养基由基础培养基、营养源、通路抑制成分、抗氧化成分、糖皮质激素、激活成分和促分化成分组成；所述基础培养基为DMEM/12培养基，所述营养源包括无血清细胞培养添加剂，所述通路抑制成分由转化生长因子-β信号抑制剂和γ-分泌酶抑制剂组成，所述激活成分为腺苷酸环化酶激活剂，以用于激活蛋白激酶A，所述抗氧化成分包括氮乙酰半胱氨酸，所述促分化成分为FH1(BRD-K4477)、FPH1(BRD-6125)或FPH2(BRD-9424)；所述营养源的体积占所述基础培养基体积的1％-2％；每1000克所述基础培养基中，所述通路抑制成分的质量为7×10-4克-3×10-2克，所述抗氧化成分的质量为3.5×10-4克-1.1克，所述糖皮质激素的质量为2.3×10-3克-5.8×10-2克，所述激活成分的质量为8.2×10-4克-2.1×10-2克，所述促分化成分的质量为1.1×10-3克-0.15克。2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述无血清细胞培养添加剂为N2添加剂或胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂。3.根据权利要求2所述的细胞培养基，其特征在于，所述胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比为25％-50％。4.根据权利要求2所述的细胞培养基，其特征在于，所述N2添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比为25％-50％。5.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述营养源还具有B27添加剂，所述B27添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比不大于100％。6.根据权利要求5所述的细胞培养基，其特征在于，所述B27添加剂占所述无血清细胞培养添加剂的体积百分比为50％-75％。7.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述转化生长因子-β信号抑制剂与所述γ-分泌酶抑制剂的质量比为3:1-5:1。8.根据权利要求7所述的细胞培养基，其特征在于，所述转化生长因子-β信号抑制剂为SB431542或A83-01，所述γ-分泌酶抑制剂为DATP、YO-01027、CompoundE或LY-411575。9.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述腺苷酸环化酶激活剂为佛司可林或环磷酸腺苷，所述糖皮质激素为地塞米松或氢化可的松，所述抗氧化成分还具有L-抗坏血酸、维生素E、类胡萝卜素或抗氧化酶。10.一种试剂盒，其特征在于，包括增殖培养基以及如权利要求1-9中任意一项所述的细胞培养基，所述增殖培养基为William'sE培养基或TEM培养基。11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还具有包被液，所述包被液由DMEM/12培养基和细胞外基质组成。12.一种细胞培养方法，其特征在于，包括：S1：提供如权利要求10所述的试剂盒，所述试剂盒包括增殖培养基和细胞培养基，将所述增殖培养基和待培养细胞悬液以2:1-4:1的体积比混合，在150倍–200倍的重力加速度...

【专利技术属性】
技术研发人员：鄢和新，王振宇，
申请(专利权)人：上海赛立维生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31