一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法技术

本发明专利技术提供一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，所述方法包括：将经预处理后的滑膜组织充分破碎；向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶并进行吹打；培养消化后打散成单个细胞；过滤后将滤液离心取下层沉淀接种至DMEM高糖培养基中贴壁培养；采用自然纯化法和反复贴壁法纯化细胞即得类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。采用本发明专利技术的培养方法30天可获得10

A Primary Culture Method of Synovial Fibroblasts from Rheumatoid Arthritis

【技术实现步骤摘要】
一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。类风湿关节炎(Rheμmatoidarthritis，RA)是一种涉及全身的自身免疫性疾病。RA的主要病理特征是关节炎滑膜慢性炎症反应，炎性细胞浸润，血管翳形成，骨和软骨进行性破坏。滑膜的过度增生和反复发作的剧烈炎症反应导致关节关节骨和软骨的破坏，造成关节磨损，关节功能障碍。虽然近年来人们对RA的治疗已经取得了一定的进展，但其具体的病因仍然不清楚。RASFs直接来源于病人病灶部位，其在RA患者骨和软骨破坏中起到重要的作用。在病患部位中大量的炎性细胞浸润使得RASFs大量增殖导致骨和软骨进行性破坏。近年来大量研究证实调控RASFs中的相关致病基因表达在RA诊断和治疗中有着较高的应用价值。因此，目前在RA病理进程中的作用研究中，RASFs成为了滑膜功能研究的重要细胞模型之一。目前RASFs的原代培养方法主要包括组织块培养法和混合酶消化法。组织块培养法由于组织块与细胞培养器皿的贴附不牢靠，易脱落，而且培养周期长，消化时间不易控制，极易污染，成功率不高。而混合酶消化法将胰酶和胶原酶混合，进行组织消化，由于胰酶对细胞膜损伤较大，而滑膜细胞脱离组织的束缚、从组织块中爬出，需要较长的消化时间，对细胞膜的损伤极大，获得的细胞状态往往不好。以往研究虽然通过机械剪切对滑膜进行一定的破碎，然后使用混合酶消化法进行消化，一定程度上提高了原代RASFs的获取效率，但是专利技术人在实验过程中发现两个主要问题：1、RA组织以纤维性组织为主，而胶原酶能够非常有效的消化纤维性组织，并且胰酶对细胞的损害非常大，长时间的消化会导致大量细胞死亡。2、原有的提取方案没有对滑膜组织块的体积进行定量，极易使酶的过量或者不足，导致细胞死亡或者消化不充分，最终原代RASFs提取效率低。
技术实现思路
基于上述现有技术的不足，本专利技术提供一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，本专利技术通过对常规原代滑膜细胞提取方法进行优化，从而大大提高滑膜细胞提取效率，能够在短期内获得大量实验样本，不仅为后续类风湿性关节炎发病机制研究奠定了基础，而且能够大大缩短实验周期。且原代培养获得RASFs和体外建系的滑膜细胞系相比，具有更高的研究价值，因此具有良好的实际应用之价值。本专利技术的一个方面，提供一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，所述方法包括：将经预处理后的滑膜组织充分破碎；向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶并进行吹打；培养消化后打散成单个细胞；过滤后将滤液离心取下层沉淀接种至DMEM高糖培养基中贴壁培养；采用自然纯化法和反复贴壁法纯化细胞即得类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。本专利技术的第二个方面，提供上述培养方法获得的类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。本专利技术的有益技术效果：本专利技术提供一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，采用本专利技术的培养方法30天可获得1010个左右的RASFs，是常规消化法的7-10倍，细胞产率大大提高，且细胞形态上更加饱满，活性更强，可以满足多种实验需要，因此是一种快速有效的原代RASFS分离培养方法。同时原代培养获得RASFs和体外建系的滑膜细胞系相比，具有更高的研究价值，具有良好的实际应用之前景。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1是本专利技术实施例1中倒置显微镜观察原有方法与本专利技术优化方法在细胞形态和数量上的差异图。图2是本专利技术实施例1中原始提取方法和本专利技术优化方法细胞提取数量差异图。图3是流式细胞术鉴定本专利技术实施例1制备的第三代RAFLs细胞纯度图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本专利技术使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。如前所述，常规原代滑膜细胞提取方法存在提取效率较低，获得的原代滑膜细胞数量较少等缺陷。有鉴于此，本专利技术的一个典型实施方式中，提供一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，所述方法包括：S1、将经预处理后的滑膜组织充分破碎；向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶；S2、培养消化后打散成单个细胞；S3、过滤后将滤液离心取下层沉淀接种至DMEM高糖培养基中贴壁培养；S4、采用自然纯化法和反复贴壁法纯化细胞即得类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。本专利技术的又一典型实施方式中，所述预处理方法包括将浸泡于生理盐水中的滑膜组织取出在无菌状态下使用PBS冲洗，去除滑膜组织中的脂肪和软骨；本专利技术的又一典型实施方式中，破碎方法为剪碎，进一步优选剪碎至＜0.5mm；本专利技术的又一典型实施方式中，Ⅲ型胶原酶的浓度优选为0.2～0.6μg/ml(优选为0.5μg/ml)，Ⅱ型胶原酶的浓度优选为10～30μg/ml(优选为20μg/ml)；通过优化选择胶原酶的配比浓度，有利于胶原酶对纤维性组织的消化，同时避免使用胰酶，从而减少对滑膜细胞的损害；本专利技术的又一典型实施方式中，滑膜组织与Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的面积体积比为0.3～0.6cm2：2～3ml：200～400μl(优选为0.5cm2：3ml：300μl)；通过限定滑膜组织与胶原酶之间的用量关系，从而避免酶加过量导致细胞死亡或者酶加量过少导致消化不充分的现象发生；本专利技术的又一典型实施方式中，向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶后反复吹打2～3min；通过吹打混匀，使酶和滑膜组织充分接触以提高消化效率；本专利技术的又一典型实施方式中，所述培养消化具体方法为：置于37℃，5％CO2细胞培养箱消化培养3～6h；本专利技术的又一典型实施方式中，打散成单个细胞具体方法为采用吹打方式，该方法较为柔缓，减少对细胞的损伤；本专利技术的又一典型实施方式中，DMEM高糖培养基中还含有有1％双抗和10％FBS；本专利技术的又一典型实施方式中，所述类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞为3-6代培养细胞，此时培养细胞活性较高。本专利技术的又一典型实施方式中，提供上述培养方法获得的类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。以下通过实施例对本专利技术做进一步解释说明，但不构成对本专利技术的限制。应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例11主要试剂仪器耗材1.1试剂试剂名称厂家产地澳洲胎牛血清Gibco美国Ⅱ型胶原酶索莱宝北京Ⅲ型胶原酶索莱宝北京DMEM细胞培养基Hyclone美国胰酶、青霉素链霉素索莱宝北京FITC标记vimentin抗体eBiosecience美国CD68抗体eBiosecience美国1.2仪器耗材2方法2.1类风湿性关节炎滑膜成纤维细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，所述方法包括：将经预处理后的滑膜组织充分破碎；向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶；培养消化后打散成单个细胞；过滤后将滤液离心取下层沉淀接种至DMEM高糖培养基中贴壁培养；采用自然纯化法和反复贴壁法纯化细胞即得类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。

【技术特征摘要】
1.一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，所述方法包括：将经预处理后的滑膜组织充分破碎；向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶；培养消化后打散成单个细胞；过滤后将滤液离心取下层沉淀接种至DMEM高糖培养基中贴壁培养；采用自然纯化法和反复贴壁法纯化细胞即得类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。2.如权利要求1所述的一种原代培养方法，其特征在于，所述预处理方法包括将浸泡于生理盐水中的滑膜组织取出在无菌状态下使用PBS冲洗，去除滑膜组织中的脂肪和软骨。3.如权利要求1所述的一种原代培养方法，其特征在于，破碎方法为剪碎，进一步优选剪碎至＜0.5mm。4.如权利要求1所述的一种原代培养方法，其特征在于，Ⅲ型胶原酶的浓度优选为0.2～0.6μg/ml(优选为0.5μg/ml)，Ⅱ型胶原酶的浓度优选为10～30μg/ml(优选为20μg/ml)。5.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘继红，王士冠，王林，
申请(专利权)人：山东省医药生物技术研究中心山东省病毒研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37