本发明专利技术公开了一种改良的小鼠门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞分离的方法，利用本发明专利技术提供的方法，可快速从小鼠肝脏中分离出大量具有高活力的门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞，所得细胞能保持良好的原代肝细胞形态特征和肝细胞的功能，为门静脉周、中央静脉周肝细胞的分离与鉴定，体外研究门静脉周、中央静脉周肝细胞代谢差异以及更深层次探索肝细胞异质性的研究提供基础。
A Method for Isolation of Periportal Hepatocytes and Pericentral Hepatocytes from Mouse Portal Vein
【技术实现步骤摘要】
一种小鼠门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞的分离方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种小鼠门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞的分离方法。
技术介绍
肝脏是机体最主要的代谢器官，承载着多种重要的生理功能。传统意义上，根据门脉三联管到中央肝静脉的位置，将肝小叶分为门静脉周、中间区域和中央静脉周。在每个肝小叶中，肝细胞因其空间位置不同而被赋予不同的功能。目前对肝脏分区的研究主要包括葡萄糖代谢、氨解毒、药物和外源性物质代谢等。鉴于PP和PV之间功能的差异，在正常生理情况下，某些基因可以特异性表达，比如E-钙黏附蛋白(E-Cad)特定表达于PP肝细胞，在PV肝细胞中几乎不表达；谷氨酸合成酶(Gs)和胆固醇7-羟化酶(Cyp7a1)特定表达于PV肝细胞，在PP肝细胞中几乎不表达。在体外研究中，原代肝细胞更能反映出肝脏在机体内的代谢水平，该技术已经被广泛用于肝脏病理、生物人工肝系统、药物代谢等研究。随着肝脏功能研究的不断深入，肝脏分区也逐步被人关注。目前，关于肝脏细胞分区分离的技术多用于大鼠；而一部分研究者使用显微切割的方法获得小鼠PP肝细胞和PV肝细胞，但这种方法会将除实质细胞以外的细胞都分离出来，且细胞损伤严重。也有文献报道小鼠PP肝细胞和PV肝细胞分离方法，但其应用插管技术灌注后续溶液，这对于小鼠这类门静脉细小的实验动物来说，操作难度大，持续时间长，难以维持较高的细胞活力。目前没有关于小鼠门静脉周和中央静脉周肝细胞分离方法的专利。因此，我们旨在改良分离方法，为研究肝细胞异质性提供更为便捷有效的技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种小鼠门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞的分离方法，利用本专利技术提供的方法，可从小鼠肝脏中分离出大量具有高活力的门静脉周肝细胞或中央静脉周肝细胞，保持良好的原代肝细胞形态特征和肝细胞的功能。为达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种小鼠门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞的分离方法，包括下述步骤：(1)小鼠门静脉周肝细胞的分离1)离体灌注机的速度调至30-40rpm/min，将一次性静脉采血针一端和离体灌注机相连，另一端从小鼠肝脏门静脉插入；2)门静脉周肝细胞分离灌注：打开机器，立即剪断下腔静脉，并把离体灌注机的速度调至50-60rpm/min，用36-38℃冲洗液从门静脉进行灌注，持续灌注直到下腔静脉处流出的液体颜色澄清；3)离体灌注机设置为逆流模式，速度为10-15rpm/min，然后使用注射器将损伤剂从下腔静脉处注射进去，直到肝脏表面出现均匀白色小点，立即将离体灌注机设置为正流模式，速度为40-50rpm/min；4)继续灌注20-30mL的冲洗液后，开始灌注36-38℃消化液，速度为40-45rpm/min，直到肝脏膨大并在出现膨大现象后3min之内塌陷下去，此为消化完成；(2)小鼠中央静脉周肝细胞的分离1)离体灌注机的速度调至30-40rpm/min，将一次性静脉采血针一端和离体灌注机相连，另一端从小鼠肝脏下腔静脉插入；2)中央静脉周肝细胞分离灌注：打开机器，立即剪断门静脉，将离体灌注机的速度调至50-60rpm/min，用36-38℃的冲洗液从下腔静脉进行灌注，持续灌注直到门静脉处流出的液体颜色澄清；3)离体灌注机设置为逆流模式，速度为10-15rpm/min，然后使用注射器将损伤剂从门静脉处注射进去，直到肝脏表面出现均匀白色小点，立即将离体灌注机设置为正流模式，速度为40-50rpm/min；4)继续灌注20-30mL的冲洗液后，开始灌注37℃的消化液，速度为40-45rpm/min，直到肝脏膨大并在出现膨大现象后3min之内塌陷下去，此为消化完成；所述消化液配方：使用DMEM将10*HBSS稀释成含有1*HBSS的溶液，加入Ⅳ胶原酶溶液使胶原酶的终浓度为0.5-0.6mg/mL；所述冲洗液配方：PBS中加入EGTA，使其终浓度为5-5.5mM；所述损伤剂配方：洋地黄皂苷溶解于灭菌超纯水中，使其终浓度为5-5.5mM；(3)小鼠门静脉周肝细胞和小鼠中央静脉周肝细胞单细胞悬液的获得将步骤(1)和(2)消化后的细胞悬液分别过60-70μm细胞筛，得小鼠门静脉周肝细胞和小鼠中央静脉周肝细胞的单细胞悬液，分别离心后重悬，即得。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1)将前期冲洗的Krebs-Henselrit溶液换成含有EGTA的PBS，节约实验成本；2)以离体器官灌注机与静脉采血针相连，避免了插管等复杂操作，同时在进行损伤时，利用离体器官灌注机的逆向动力，可以使得洋地黄皂苷均匀充盈肝脏；3)洋地黄皂苷进行肝脏损伤时，损伤浓度选取5mmol/L，与之前损伤方法相比，节约了药物使用剂量，减少了对细胞造成的损伤；4)灌注结束后，将肝脏研磨并置于细胞培养箱孵育10min，使得肝细胞消化更加充分，避免了反复吹打对细胞活性造成的影响；5)本专利技术直接用60-70μm细胞筛过滤细胞悬液，发现并没有出现过滤缓慢的现象。附图说明图1为分离的小鼠门静脉周、中央静脉周肝细胞的细胞损伤情况示意图。图2为门静脉周、中央静脉周肝细胞特异性蛋白的表达示意图；pp，门静脉周肝细胞；pv，中央静脉周肝细胞；GS，谷氨酰胺合成酶；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；E-Cad，E-钙黏附素。图3为门静脉周、中央静脉周肝细胞中GS和E-cad蛋白表达量示意图；pp，门静脉周肝细胞；pv，中央静脉周肝细胞。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。下述实施例中试验方案若无特殊说明，均为常规操作方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1：一种小鼠门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞的分离方法，包括下述步骤：(1)小鼠门静脉周肝细胞的分离1)离体灌注机(ISMATECISM827B)的速度调至30rpm/min，将一次性静脉采血针(碟翼型24G)一端和离体灌注机(ISMATECISM827B)相连，另一端从小鼠肝脏门静脉插入；2)门静脉周肝细胞分离灌注：打开机器，立即剪断下腔静脉，并把离体灌注机(ISMATECISM827B)的速度调至60rpm/min，用37℃冲洗液从门静脉进行灌注，持续灌注直到下腔静脉处流出的液体颜色澄清；3)离体灌注机设置为逆流模式(可观察到液体回流现象)，速度为10rpm/min，然后使用注射器将损伤剂从下腔静脉处注射进去，直到肝脏表面出现均匀白色小点，立即将离体灌注机设置为正流模式，速度为50rpm/min；4)继续灌注20mL的冲洗液后，开始灌注37℃消化液，速度为45rpm/min，直到肝脏膨大并在出现膨大现象后3min之内塌陷下去，此为消化完成；(2)小鼠中央静脉周肝细胞的分离1)离体灌注机(ISMATECISM827B)的速度调至30rpm/min，将一次性静脉采血针(碟翼型24G)一端和离体灌注机相连，另一端从小鼠肝脏下腔静脉插入；2)中央静脉周肝细胞分离灌注：打开机器，立即剪断门静脉，将离体灌注机(ISMATECISM827B)的速度调至60rpm/min，用37℃的冲洗液从下腔静脉进行灌注，持续灌注直到门静脉处流出的液体颜色澄清；3)离体灌注机设置为逆流模式(可观察到液体回流现象)，速度为10rpm/mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种小鼠门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞的分离方法，包括下述步骤：（1）小鼠门静脉周肝细胞的分离1)离体灌注机的速度调至30‑40 rpm/min，将一次性静脉采血针一端和离体灌注机相连，另一端从小鼠肝脏门静脉插入；2)门静脉周肝细胞分离灌注：打开机器，立即剪断下腔静脉，并把离体灌注机的速度调至50‑60rpm/min，用36‑38℃冲洗液从门静脉进行灌注，持续灌注直到下腔静脉处流出的液体颜色澄清；3)离体灌注机设置为逆流模式，速度为10‑15rpm/min，然后使用注射器将损伤剂从下腔静脉处注射进去，直到肝脏表面出现均匀白色小点，立即将离体灌注机设置为正流模式，速度为40‑50rpm/min；4)继续灌注20‑30mL的冲洗液后，开始灌注36‑38℃消化液，速度为40‑45rpm/min，直到肝脏膨大并在出现膨大现象后3min之内塌陷下去，此为消化完成；（2）小鼠中央静脉周肝细胞的分离1)离体灌注机的速度调至30‑40rpm/min，将一次性静脉采血针一端和离体灌注机相连，另一端从小鼠肝脏下腔静脉插入；2)中央静脉周肝细胞分离灌注：打开机器，立即剪断门静脉，将离体灌注机的速度调至50‑60rpm/min，用36‑38℃的冲洗液从下腔静脉进行灌注，持续灌注直到门静脉处流出的液体颜色澄清；3)离体灌注机设置为逆流模式，速度为10‑15rpm/min，然后使用注射器将损伤剂从门静脉处注射进去，直到肝脏表面出现均匀白色小点，立即将离体灌注机设置为正流模式，速度为40‑50rpm/min；4)继续灌注20‑30mL的冲洗液后，开始灌注37℃的消化液，速度为40‑45rpm/min，直到肝脏膨大并在出现膨大现象后3min之内塌陷下去，此为消化完成；所述消化液配方：使用DMEM将10*HBSS稀释成含有1*HBSS的溶液，加入Ⅳ胶原酶溶液使胶原酶的终浓度为0.5‑0.6mg/mL；所述冲洗液配方：PBS中加入EGTA，使其终浓度为5‑5.5mM；所述损伤剂配方：洋地黄皂苷溶解于灭菌超纯水中，使其终浓度为5‑5.5mM；（3）小鼠门静脉周肝细胞和小鼠中央静脉周肝细胞单细胞悬液的获得将步骤（1）和（2）消化后的细胞悬液分别过60‑70μm细胞筛，得小鼠门静脉周肝细胞和小鼠中央静脉周肝细胞的单细胞悬液，分别离心后重悬，即得。...
【技术特征摘要】
1.一种小鼠门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞的分离方法，包括下述步骤：（1）小鼠门静脉周肝细胞的分离1)离体灌注机的速度调至30-40rpm/min，将一次性静脉采血针一端和离体灌注机相连，另一端从小鼠肝脏门静脉插入；2)门静脉周肝细胞分离灌注：打开机器，立即剪断下腔静脉，并把离体灌注机的速度调至50-60rpm/min，用36-38℃冲洗液从门静脉进行灌注，持续灌注直到下腔静脉处流出的液体颜色澄清；3)离体灌注机设置为逆流模式，速度为10-15rpm/min，然后使用注射器将损伤剂从下腔静脉处注射进去，直到肝脏表面出现均匀白色小点，立即将离体灌注机设置为正流模式，速度为40-50rpm/min；4)继续灌注20-30mL的冲洗液后，开始灌注36-38℃消化液，速度为40-45rpm/min，直到肝脏膨大并在出现膨大现象后3min之内塌陷下去，此为消化完成；（2）小鼠中央静脉周肝细胞的分离1)离体灌注机的速度调至30-40rpm/min，将一次性静脉采血针一端和离体灌注机相连，另一端从小鼠肝脏下腔静脉插入；2)中央静脉周肝细胞分离灌注：打开机器，立即剪断门...
【专利技术属性】
技术研发人员：张利生，黎俊，翟元森，秦丹，刘圣辉，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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