利用黄连素减轻脂多糖建立体外人子宫内膜炎模型的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用黄连素减轻脂多糖建立体外人子宫内膜炎模型的方法，该方法包括以下步骤：⑴原代人子宫内膜基质细胞的分离培养：采用体外原代细胞培养，二次网筛法提取2~3代人子宫内膜基质细胞；⑵CCK8法筛选LPS作用于细胞的适宜浓度及时间；⑶CCK8法筛选BBR作用于细胞的适宜浓度及时间；⑷ELISA检测IL‑1β、TNF‑α的含量；⑸数据分析。本发明专利技术通过CCK8法检测不同浓度梯度LPS和BBR在不同时间作用下对hESCs的毒性作用，并用ELISA鉴定LPS诱导的炎症模型，从而确定黄连素对人子宫内膜炎有一定的疗效，是治疗子宫内膜炎的潜在药物。

Establishment of a human endometritis model in vitro by berberine to alleviate lipopolysaccharide

【技术实现步骤摘要】
利用黄连素减轻脂多糖建立体外人子宫内膜炎模型的方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及利用黄连素减轻脂多糖建立体外人子宫内膜炎模型的方法。
技术介绍
慢性子宫内膜炎(chronicendometritis，CE)是由于细菌入侵宫腔而导致的子宫内膜持续性炎症病变，其特点为子宫内膜间质区异常浆细胞浸润。研究显示CE的主要致病菌是常见菌，如大肠杆菌、链球菌等，其次为支原体。子宫内膜由两层组成：靠近子宫腔的功能层和位于子宫肌层附近的基底层。白细胞可见于基底层和功能层，腺体腔内或上皮内位置。在月经周期的正常增殖期和分泌期早期，白细胞占基质细胞的10%，在月经周期的分泌期中晚期，白细胞占基质细胞的20%。在正常人子宫内膜中，白细胞主要是由T细胞，巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞组成，B细胞仅占整个白细胞群的不到1%。在功能层中很少见到子宫内膜B细胞，但在基底层中发现大量被T淋巴细胞包围在中央区域的B细胞。在CE中，大量B细胞局部渗入子宫内膜组织，这些B细胞不仅聚集在间质区，而且还侵入腺上皮区域和腔内。研究证实CE子宫内膜B细胞外渗与涉及的多种促炎分子的异常表达有关。同时，源自大肠杆菌的脂多糖在体外分离的人子宫微血管内皮细胞和子宫内膜细胞中也诱导这些促炎分子的表达。另一个假设是基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinase，MMPs）在CE，炎症和植入失败中的作用。MMPs是锌依赖性蛋白水解酶家族，其影响细胞外基质的重塑和细胞迁移。MMPs表达异常与子宫内膜异位症，自身免疫性疾病和炎症性疾病等多种疾病有关。MMP-2和MMP-9已在小鼠和人类子宫内膜基质中被鉴定。CE的临床表现通常无症状或表现为月经失调（经期延长，痛经，经间期出血等）、白带增多和性质异常（粘液脓性、血性白带伴恶臭味）、下腹部坠痛等，在生殖方面表现为原发或继发性不孕。临床常用治疗子宫内膜炎的方法为口服抗生素，但由于抗生素的过度使用，细菌产生了耐药性，以及多种细菌的混合感染、内膜炎的反复发作使得抗生素治疗CE的效果不佳，因此选择更有效的药物显得更加关键。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，可以激活体内免疫细胞如中性粒细胞、淋巴细胞等，促进炎性细胞分泌多种炎性因子，引起强烈炎症和免疫反应。目前，LPS已有报道成功建立了诱导体外人子宫内膜基质细胞炎症模型。黄连素(Berberine，BBR)又名盐酸小檗碱，是一种异喹啉类生物碱，可从黄连、黄柏、三颗针等植被中提取。黄连素的副作用较小，成本低，临床价值高，其抗炎、抗微生物、抗肿瘤、降血糖、调血脂及免疫抑制等作用成为临床各系统应用最多的中药单体。目前，黄连素治疗人子宫内膜炎的疗效还无相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用黄连素减轻脂多糖建立体外人子宫内膜炎模型的方法。为解决上述问题，本专利技术所述的利用黄连素减轻脂多糖建立体外人子宫内膜炎模型的方法，包括以下步骤：⑴原代人子宫内膜基质细胞的分离培养：①从盛有无菌生理盐水的标本瓶中取出人子宫内膜组织，用PBS清洗该人子宫内膜组织2~3遍，并用眼科剪将组织剪碎至直径＜1mm；②将所述步骤①所得的内膜组织移至15mL离心管中，加入5~7mLIV型胶原酶，于37℃水浴锅中消化40~60min，每隔10min摇晃一次离心管，直至组织变为絮状；再加入5~7mL的DMEM/F-12完全培养液终止消化；③依次用100目筛网、400目滤网过滤，所得的滤液即为含间质细胞的细胞悬液；④将所述含间质细胞的细胞悬液1200r/min离心5min，弃上清，即得混有红细胞的间质细胞团；⑤所述混有红细胞的间质细胞团中加入DMEM/F-12完全培养液吹打均匀，移入培养皿，于37℃、5%CO2培养箱中培养，第二天换液；⑥待所述步骤⑤所得的细胞铺满培养皿后，弃掉培养液，用PBS冲洗该细胞；然后加入0.25%胰蛋白酶消化液1mL消化细胞，于37℃、5%CO2培养箱中消化1min，在倒置显微镜下观察，当大多数细胞由梭形变为圆形，细胞间隙扩大时，加入1mLDMEM/F-12完全培养液终止消化；⑦反复吹打所述步骤⑥所得的细胞，以1：3的比例接种于DMEM/F-12完全培养液，并放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养，隔天换液；⑧待所述步骤⑦所得的细胞铺满培养皿后，重复步骤⑥~⑦，直至得到2~3代人子宫内膜基质细胞（hESCs）；⑵CCK8法筛选LPS作用于细胞的适宜浓度及时间：ⅰ接种：取对数生长期的所述2~3代人子宫内膜基质细胞（hESCs），采用0.25%胰蛋白酶消化细胞获得细胞悬液B，用细胞计数板计数，加DMEM/F-12培养液将细胞密度调至5×104个/mL，每孔加入100μL的细胞悬液B，放入37℃、5%CO2培养箱中培养；ⅱ饥饿：培养24h后，弃去原培养液，每孔加100μL不含FBS的DMEM/F-12培养液饥饿12h；ⅲ将10mg/mLLPS试剂分别稀释成浓度为0、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LPS；ⅳ弃去原培养液，分别加入含0、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LPS且不含FBS的DMEM/F-12培养液100μL，每个浓度设6个复孔，重复三次；ⅴ将CCK8与不含FBS的DMEM/F-12培养液按1:10的体积比配制，LPS分别作用ESC细胞24、48h后，弃去原培养液，每孔加入100μL含CCK8的DMEM/F-12培养液；ⅵ将96孔板放入培养箱中继续培养2h，2h后于酶标仪中450nm波长测吸光度；ⅶ按下式计算各个不同浓度及时间组的细胞增长率：细胞相对增长率（%）=（OD加药组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）×100%；⑶CCK8法筛选BBR作用于细胞的适宜浓度及时间：a接种：取对数生长期的所述2~3代人子宫内膜基质细胞（hESCs），采用0.25%胰蛋白酶消化细胞获得细胞悬液B，用细胞计数板计数，加DMEM/F-12培养液将细胞密度调至5×104个/mL，每孔加入100μL的细胞悬液B，放入37℃、5%CO2培养箱中培养；b饥饿：培养24h后，弃去原培养液，每孔加100μL不含FBS的DMEM/F-12培养液饥饿12h；c将2mg/mLBBR试剂分别稀释成浓度为0、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL的LPS；d弃去原培养液，分别加入含0、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL的LPS且不含FBS的DMEM/F-12培养液100μL，每个浓度设6个复孔，重复三次；e将CCK8与不含FBS的DMEM/F-12培养液按1:10的体积比配制，BBR分别作用ESC细胞12、24、48h后，弃去原培养液，每孔加入100μL含CCK8的DMEM/F-12培养液；f将96孔板放入培养箱中继续培养2h，2h后于酶标仪中450nm波长测吸光度；g按下式计算各个不同浓度及时间组的细胞增长率：细胞相对增长率（%）=（OD加药组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）×100%；⑷ELISA检测IL-1β、TNF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用黄连素减轻脂多糖建立体外人子宫内膜炎模型的方法，包括以下步骤：⑴原代人子宫内膜基质细胞的分离培养：①从盛有无菌生理盐水的标本瓶中取出人子宫内膜组织，用PBS清洗该人子宫内膜组织2~3遍，并用眼科剪将组织剪碎至直径＜1mm；②将所述步骤①所得的内膜组织移至15 mL离心管中，加入5~7 mL IV型胶原酶，于37℃水浴锅中消化40~60 min，每隔10 min摇晃一次离心管，直至组织变为絮状；再加入5~7 mL的DMEM/F‑12完全培养液终止消化；③依次用100目筛网、400目滤网过滤，所得的滤液即为含间质细胞的细胞悬液；④将所述含间质细胞的细胞悬液1200r/min离心5min，弃上清，即得混有红细胞的间质细胞团；⑤所述混有红细胞的间质细胞团中加入DMEM/F‑12完全培养液吹打均匀，移入培养皿，于37℃、5% CO2培养箱中培养，第二天换液；⑥待所述步骤⑤所得的细胞铺满培养皿后，弃掉培养液，用PBS冲洗该细胞；然后加入0.25% 胰蛋白酶消化液1mL消化细胞，于37℃、5% CO2培养箱中消化1min，在倒置显微镜下观察，当大多数细胞由梭形变为圆形，细胞间隙扩大时，加入1mL DMEM/F‑12完全培养液终止消化；⑦反复吹打所述步骤⑥所得的细胞，以1：3的比例接种于DMEM/F‑12完全培养液，并放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养，隔天换液；⑧待所述步骤⑦所得的细胞铺满培养皿后，重复步骤⑥~⑦，直至得到2~3代人子宫内膜基质细胞；⑵CCK8法筛选LPS作用于细胞的适宜浓度及时间：ⅰ接种：取对数生长期的所述2~3代人子宫内膜基质细胞，采用0.25% 胰蛋白酶消化细胞获得细胞悬液B，用细胞计数板计数，加DMEM/F‑12培养液将细胞密度调至5×104个/mL，每孔加入100μL的细胞悬液B，放入37℃、5% CO2培养箱中培养；ⅱ饥饿：培养24h后，弃去原培养液，每孔加100μL不含FBS的DMEM/F‑12培养液饥饿12h；ⅲ将10 mg/mL LPS试剂分别稀释成浓度为0、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400μg/mL的LPS；ⅳ弃去原培养液，分别加入含0、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400μg/mL的LPS且不含FBS的DMEM/F‑12培养液100μL，每个浓度设6个复孔，重复三次；ⅴ将CCK8与不含FBS的DMEM/F‑12培养液按1:10的体积比配制，LPS分别作用ESC细胞24、48h 后，弃去原培养液，每孔加入100μL含CCK8的DMEM/F‑12培养液；ⅵ将96孔板放入培养箱中继续培养2h，2h后于酶标仪中450nm波长测吸光度；ⅶ按下式计算各个不同浓度及时间组的细胞增长率：细胞相对增长率（%）=（OD加药组‑OD空白组）/（OD对照组‑OD空白组）×100%；⑶CCK8法筛选BBR作用于细胞的适宜浓度及时间：a接种：取对数生长期的所述2~3代人子宫内膜基质细胞，采用0.25% 胰蛋白酶消化细胞获得细胞悬液B，用细胞计数板计数，加DMEM/F‑12培养液将细胞密度调至5×104个/mL，每孔加入100μL的细胞悬液B，放入37℃、5% CO2培养箱中培养；b饥饿：培养24h后，弃去原培养液，每孔加100μL不含FBS的DMEM/F‑12培养液饥饿12h；c将2 mg/mL BBR试剂分别稀释成浓度为0、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40μg/mL的LPS；d弃去原培养液，分别加入含0、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40μg/mL的LPS且不含FBS的DMEM/F‑12培养液100μL，每个浓度设6个复孔，重复三次；e将CCK8与不含FBS的DMEM/F‑12培养液按1:10的体积比配制，BBR分别作用ESC细胞12、24、48h 后，弃去原培养液，每孔加入100μL含CCK8的DMEM/F‑12培养液；f将96孔板放入培养箱中继续培养2h，2h后于酶标仪中450nm波长测吸光度；g按下式计算各个不同浓度及时间组的细胞增长率：细胞相对增长率（%）=（OD加药组‑OD空白组）/（OD对照组‑OD空白组）×100%；⑷ELISA检测IL‑1β、TNF‑α的含量；⑸数据分析。...

【技术特征摘要】
1.利用黄连素减轻脂多糖建立体外人子宫内膜炎模型的方法，包括以下步骤：⑴原代人子宫内膜基质细胞的分离培养：①从盛有无菌生理盐水的标本瓶中取出人子宫内膜组织，用PBS清洗该人子宫内膜组织2~3遍，并用眼科剪将组织剪碎至直径＜1mm；②将所述步骤①所得的内膜组织移至15mL离心管中，加入5~7mLIV型胶原酶，于37℃水浴锅中消化40~60min，每隔10min摇晃一次离心管，直至组织变为絮状；再加入5~7mL的DMEM/F-12完全培养液终止消化；③依次用100目筛网、400目滤网过滤，所得的滤液即为含间质细胞的细胞悬液；④将所述含间质细胞的细胞悬液1200r/min离心5min，弃上清，即得混有红细胞的间质细胞团；⑤所述混有红细胞的间质细胞团中加入DMEM/F-12完全培养液吹打均匀，移入培养皿，于37℃、5%CO2培养箱中培养，第二天换液；⑥待所述步骤⑤所得的细胞铺满培养皿后，弃掉培养液，用PBS冲洗该细胞；然后加入0.25%胰蛋白酶消化液1mL消化细胞，于37℃、5%CO2培养箱中消化1min，在倒置显微镜下观察，当大多数细胞由梭形变为圆形，细胞间隙扩大时，加入1mLDMEM/F-12完全培养液终止消化；⑦反复吹打所述步骤⑥所得的细胞，以1：3的比例接种于DMEM/F-12完全培养液，并放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养，隔天换液；⑧待所述步骤⑦所得的细胞铺满培养皿后，重复步骤⑥~⑦，直至得到2~3代人子宫内膜基质细胞；⑵CCK8法筛选LPS作用于细胞的适宜浓度及时间：ⅰ接种：取对数生长期的所述2~3代人子宫内膜基质细胞，采用0.25%胰蛋白酶消化细胞获得细胞悬液B，用细胞计数板计数，加DMEM/F-12培养液将细胞密度调至5×104个/mL，每孔加入100μL的细胞悬液B，放入37℃、5%CO2培养箱中培养；ⅱ饥饿：培养24h后，弃去原培养液，每孔加100μL不含FBS的DMEM/F-12培养液饥饿12h；ⅲ将10mg/mLLPS试剂分别稀释成浓度为0、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LPS；ⅳ弃去原培养液，分别加入含0、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LPS且不含FBS的DMEM/F-12培养液100μL，每个浓度设6个复孔，重复三次；ⅴ将CCK8与不含FBS的DMEM/F-12培养液按1:10的体积比配制，LPS分别作用ESC细胞24、48h后，弃去原培养液，每孔加入100μL含CCK8的DMEM/F-12培养液；ⅵ将96孔板放入培养箱中继续培养2h，2h后于酶标仪中450nm波长测吸光度；ⅶ按下式计算各个不同浓度及时间组的细胞增长率：细胞相对增长率（%）=（OD加药组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白...

【专利技术属性】
技术研发人员：马晓玲，王一青，骆晓荣，
申请(专利权)人：兰州大学第一医院，
类型：发明
国别省市：甘肃,62