一种肠道外泌体提取方法技术

本发明专利技术提供一种肠道外泌体提取方法，包括如下步骤：⑴管状肠样本处理及清洗；⑵利用二硫苏糖醇溶液反复清洗肠道组织；⑶分离肠上皮细胞；⑷分离肠上皮细胞；⑸将分离液离心取上清进行初步过滤，去除细胞及细胞碎片；⑹获取向体内分泌的外泌体。本发明专利技术利用EDTA消化法高效地将肠上皮层及粘膜下层分离，再从分离液中用超速离心法获取肠道向体内分泌的外泌体。相对于常规组织酶消化获取外泌体的方法，此方法成本更低、获得的外泌体纯度更高。

A method for extracting intestinal exosomes

【技术实现步骤摘要】
一种肠道外泌体提取方法
本专利技术涉及一种提取方法，尤其是一种高效率、低成本的实验动物肠道外泌体提取方法，属于实验动物的检测检验

技术介绍
肠上皮细胞作为机体接触外界的第一门户，需要能够不断接受来自食物、肠道微生物等外界物的刺激，进而调节机体内部做出合理的应答。目前已有大量的证据表明，肠道可以调控机体各个部位的器官和组织。研究结果显示，肠上皮可以通过“肠脑循环”影响神经炎症及线粒体功能，与神经退行性疾病、脑卒中等密切相关；还能够以“肠肌轴”引起骨骼肌代谢异常、细胞数量及细胞体积下降，进而诱发肌肉功能的下降；更有研究报道，肠道与缺血相关性疾病、心脏淀粉样变性、扩张型心肌病和心内膜心肌纤维化发生率增加密切相关。因而，肠道是远端器官和组织的重要调节者。然而，对于肠道调控远端的方法还是未知。外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”过程而形成的细胞外纳米级小囊泡，可以转运核酸（如微小RNA，miRNA）、蛋白质和脂质等生物活性分子，进入受体细胞中发挥调控作用，是目前器官或组织之间远程调控的重要研究靶点。已有研究者在肠上皮肿瘤细胞株中证实，肠上皮细胞具有强于其他器官的外泌体分泌功能。肠上皮细胞以极化方式分泌外泌体，一方面朝向肠腔，这部分外泌体可能是宿主microRNAs能够突破肠道自身的天然粘液屏障，影响肠道微生物的主要来源；另一方面分泌至粘膜下，进而通过粘膜下回流系统到达远端器官或组织，实现重要的远程调控。目前对外泌体的提取主要限于自血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液，虽然2017年Pérez-González等创新性地利用木瓜酶对脑细胞进行解离，从脑细胞外间隙中成功提取到了外泌体，但该方法并不适合肠道。因为，肠粘膜为皱褶样结构，极为复杂且与粘膜下层紧密相连、无法进行机械性分离。
技术实现思路
本专利技术针对上述提出的技术问题，提出一种肠道外泌体提取方法，根据肠道上皮双向性的组织特点，利用EDTA消化法高效地将肠上皮层及粘膜下层分离，再从分离液中用超速离心法获取肠道向体内分泌的外泌体，分别获取肠道向体外及体内分泌的外泌体。本专利技术解决以上技术问题的技术方案是：提供一种肠道外泌体提取方法，包括如下步骤：⑴管状肠样本处理及清洗；⑵利用二硫苏糖醇溶液反复清洗肠道组织，可减少浆膜面细胞对提取过程的污染；⑶收集步骤②的洗涤液，经低温超速离心获取向体外分泌的外泌体；⑷分离肠上皮细胞：将步骤②中的肠管移至EDTA肠上皮分离液中，并放置于冰上孵育25-40min促使上皮层脱落，再采用震荡至上清浑浊；⑸将分离液离心取上清进行初步过滤，去除细胞及细胞碎片；⑹将步骤⑤获取的过滤液，经低温超速离心获取向体内分泌的外泌体。本专利技术的进一步限定技术方案，前述的肠道外泌体提取方法，所述EDTA是一种与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+二价金属离子结合的螯合剂，通过该螯合剂螯合肠上皮细胞的Ca2+，使肠上皮细胞的Ca2+与粘膜下层温和分离，释放粘膜下层细胞外基质。前述的肠道外泌体提取方法，所述二硫苏糖醇溶液由1μM二硫苏糖醇与PBS溶液混合制备；所述PBS溶液中无Mg2+、Ca2+、Mn2+无Fe2+二价金属离子。前的肠道外泌体提取方法，所述步骤⑤离心分离4-6min，离心力设定9000-10000g；所述初步过滤采用200nm滤器过滤。前述的肠道外泌体提取方法，所述步骤③和步骤⑥中的超速离心工序离心分离2-3h，离心力设定100000-120000g。所述步骤③和步骤⑥中的沉淀物经戊二醛、二甲胂酸钠和四氧化锇固定处理后，即可进行电镜下验证。进一步的，前述的肠道外泌体提取方法，所述步骤①的管状肠样本处理及清洗中，取管状肠道样本，使用眼科镊将其内向外反转，用外科线将两端扎闭。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术方法能够获取不含亚细胞器或碎片的纯外泌体制剂，更为透彻研究肠道远程调控作用提供了实验基础和可能性。通过利用EDTA消化法高效地将肠上皮层及粘膜下层分离，再从分离液中用超速离心法获取肠道向体内分泌的外泌体。相对于常规组织酶消化获取外泌体的方法，此方法成本更低、获得的外泌体纯度更高。附图说明图1为本专利技术实施例电镜下体外分泌的外泌体图。图2为本专利技术实施例电镜下体内分泌的外泌体图。图3为本实施例外泌体表面特异性标志CD63（26KD）、HSP70（70KD）、TSG101（44KD）Westernblotting图。图4为本实施例外泌体直径大小测定峰图。具体实施方式本实施例提供一种肠道外泌体提取方法，包括以下步骤：⑴肠样本处理：取管状肠道样本，使用眼科镊将其内向外反转，用外科线将两端扎闭；⑵洗涤：利用1μM二硫苏糖醇与不含Mg2+、Ca2+、Mn2+无Fe2+二价金属离子PBS的溶液反复清洗肠道组织至洗涤液澄清；⑶获取向体外分泌的外泌体：收集步骤②的洗涤液，经低温超速离心分离保留沉淀，离心分离2.5h，离心力设定100000g；用冰PBS溶液进行洗涤；⑷分离肠上皮细胞：将步骤②中的肠管移至EDTA肠上皮分离液中，EDTA肠上皮分离液采用8mMEDTA与不含Mg2+、Ca2+、Mn2+无Fe2+二价金属离子PBS的溶液配置，并将该分离液放置在冰上孵育30分钟；弃分离液，加入新鲜冰PBS溶液，PBS溶液中不含Mg2+、Ca2+、Mn2+无Fe2+二价金属离子；剧烈震荡至上清浑浊，使肠管的上皮层脱落；⑸离心、过滤：将步骤④中洗涤液离心分离取上清，离心分离5min，离心力设定10000g；在通过200nm滤器进行初步过滤，⑹获取向体内分泌的外泌体：将步骤⑤获取的过滤液，经低温超速离心分离，离心分离2.5h，离心力设定100000g；保留沉淀，用冰PBS进行洗涤；⑺电镜下验证：步骤③、⑥获得的肠上皮组织分泌的外泌体沉淀经戊二醛、二甲胂酸钠和四氧化锇固定处理后，在电镜下进行观察，通过图3和图4可见外泌体呈双凹性结构。Westernblotting检测外泌体表面特异性标志CD63（26KD）、HSP70（70KD）、TSG101（44KD）的表达；Nanoparticletrackinganalysis(NTA)测定外泌体的直径在60-150nm之间，峰值在70nm。除上述实施例外，本专利技术还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本专利技术要求的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肠道外泌体提取方法，其特征在于包括如下步骤：⑴管状肠样本处理及清洗；⑵利用二硫苏糖醇溶液反复清洗肠道组织；⑶收集步骤②的洗涤液，经低温超速离心获取向体外分泌的外泌体；⑷分离肠上皮细胞：将步骤②中的肠管移至EDTA肠上皮分离液中，并放置于冰上孵育25‑40min促使上皮层脱落，再采用震荡至上清浑浊；⑸将分离液离心取上清进行初步过滤，去除细胞及细胞碎片；⑹将步骤⑤获取的过滤液，经低温超速离心获取向体内分泌的外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种肠道外泌体提取方法，其特征在于包括如下步骤：⑴管状肠样本处理及清洗；⑵利用二硫苏糖醇溶液反复清洗肠道组织；⑶收集步骤②的洗涤液，经低温超速离心获取向体外分泌的外泌体；⑷分离肠上皮细胞：将步骤②中的肠管移至EDTA肠上皮分离液中，并放置于冰上孵育25-40min促使上皮层脱落，再采用震荡至上清浑浊；⑸将分离液离心取上清进行初步过滤，去除细胞及细胞碎片；⑹将步骤⑤获取的过滤液，经低温超速离心获取向体内分泌的外泌体。2.如权利要求1所述的肠道外泌体提取方法，其特征在于：所述EDTA是一种与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+二价金属离子结合的螯合剂，通过该螯合剂螯合肠上皮细胞的Ca2+，使肠上皮细胞的Ca2+与粘膜下层温和分离，释放粘膜下层细胞外基质。3.如权利要求1所述的肠道外泌体提取方法，其特征在于：所述二硫苏糖醇溶液由1μM二硫...

【专利技术属性】
技术研发人员：狄文娟，周逸婵，夏凡，丁国宪，
申请(专利权)人：江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32