一种肝癌类器官模型的体外构建方法技术

本发明专利技术公开了一种肝癌类器官模型的体外构建方法，将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按特定比例混悬于培养基A；培养至第4天，半量换液维持培养；第7天开始，换为培养基B，连续培养7天；第14天传代扩增培养。本发明专利技术基于肿瘤微环境中复杂的细胞构成，快速构建大小均一、结构稳定、可检测抗癌药物有效性，并可扩增培养的3D肝癌类器官体外模型。本发明专利技术构建的肝癌类器官模型方法简易，构建迅速，可操作性强，适用于研究肝癌发生发展机制、以及肝癌药物高通量筛选等，具有产业化意义。

An in vitro construction method of an organoid model of hepatocellular carcinoma

【技术实现步骤摘要】
一种肝癌类器官模型的体外构建方法
本专利技术涉及一种肝癌类器官模型的体外构建方法。
技术介绍
肝癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，全球发病率和肿瘤相关致死率位居前列。病原学显示，导致肝癌的因素众多，乙肝或丙肝病毒感染，非酒精性脂肪肝，酗酒，肥胖等。肝癌具有异质性，耐药性和转移复发性，这给肝癌的治疗带来了极大的挑战。目前来说，对于肝癌的研究模型主要分为体内研究模型和体外研究模型。其中体外研究模型包括传统的平面2D培养和近年出现的三维培养。尽管在肝癌发生机制和肝癌药物筛选上具有一定的参考意义，但这种单细胞组分的模型往往忽视了多种细胞间或细胞-胞外基质间的相互作用。肝癌的进展并不是单一肿瘤细胞的增殖，其发生发展与复杂的肿瘤微环境和微环境中的多种成分细胞有关。因此，一种包含多种肝癌相关细胞并能模拟肝癌微环境的体外模型亟待开发。类器官是一种利用哺乳动物干细胞或成体细胞的特性构建的具有多种特异细胞类型的体外模型。近来多项研究报道，这些有复杂内部结构的类器官，在功能及构造上已经趋近于相应体内结构。基于多细胞组分的类器官体外肿瘤模型，可以重现在肿瘤组织中肿瘤细胞与其他肿瘤相关细胞的互相作用，如肿瘤相关本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：包括下列步骤：（1）将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，混悬于培养基A，静置培养；（2）第4天使用培养基A半量换液，维持培养；（3）第7天换为培养基B培养7天；（4）第14天取肝癌类器官消化传代，消化后的细胞按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养；所述培养基A包括：青霉素、链霉素、I型鼠尾胶原蛋白、维生素C、牛胰岛素、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和DMEM/F12培养基；所述培养基B包括：青霉素、链霉素、转铁蛋白、维生素C、牛胰岛素、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血...

【技术特征摘要】
1.一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：包括下列步骤：（1）将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，混悬于培养基A，静置培养；（2）第4天使用培养基A半量换液，维持培养；（3）第7天换为培养基B培养7天；（4）第14天取肝癌类器官消化传代，消化后的细胞按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养；所述培养基A包括：青霉素、链霉素、I型鼠尾胶原蛋白、维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和DMEM/F12培养基；所述培养基B包括：青霉素、链霉素、转铁蛋白、维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、Wnt3a、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和DMEM/F12培养基。2.根据权利要求1所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，使用计数仪计数，按7:2:1的特定比例，混悬于培养基A。3.根据权利要求书2所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按特定比例混匀于培养基A后，计数并按每孔2000个细胞使用排枪均匀地接种于96孔-超低吸附圆底细胞板，每孔接种细胞混悬液体积为100µL。4.根据权利要求书3的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按比例混悬于培养基A，接种于96孔-超低吸附圆底细胞板，然后放入37℃二氧化碳培养箱，静置培养，尽量避免移动。5.根据权利要求书4所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：第4天半量换液一次，使用微量移液枪紧贴培养基液面，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑文杰，姚登福，张捷，金云峰，倪温恺，徐育青，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32