一种类器官球体的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种类器官球体的制备方法，所述制备方法包括：将含细胞的基质胶和氟油分别通入到三通装置中得到细胞球体，经过培养后形成类器官球体；本发明专利技术提供的类器官球体的制备方法，利用微流控的方法生成单分散的生物材料类器官，实现了高通量生产，类器官的大小、形状和结构可控并且均一，相比于2D肿瘤敏感性预测模型，本发明专利技术制备的类器官结合了肿瘤微环境因素预测结果更准确；相比于PDX小鼠肿瘤敏感性预测模型，本发明专利技术的建模周期更短，费用更低；相比于普通的基因测序，本发明专利技术临床预测率更高；本发明专利技术提供的类器官的制备方法对于临床应用具有重要意义和价值，为相关结果的检测提供了重要的依据。

A preparation method of organoid spheres

【技术实现步骤摘要】
一种类器官球体的制备方法
本专利技术属于医疗器械领域，涉及一种类器官球体的制备方法。
技术介绍
类器官(organoid)是体外三维(3D)培养构建出的多细胞团，具有自我更新和自我组织能力，并且维持了其来源组织的生理结构和功能的特点。肿瘤类器官则是来源于肿瘤组织的类器官，是研究肿瘤生物学新型有力工具。类器官技术是近十年来发展最为迅猛的一类体外培养技术，曾被誉为2013年度最为重要的科学进展之一。2014年，Lancaster和Knoblich正式对类器官做出了系统科学的定义，为类器官技术未来的发展奠定了理论基础。目前类器官培养技术是将多能胚胎干细胞或者诱导多能干细胞包藏于细胞外基质matrigel中，然后在特定细胞因子的培养基中培养，例如含有表皮细胞生长因子、R-spondin蛋白和头蛋白足以长期维持小肠的类器官生长，而结肠来源的类器官需要添加烟酰胺、p38抑制剂SB202190、前列腺素E2和Alk抑制剂A83-01等。进过一段时间培养干细胞会形成器官特异性细胞类型集合并具有器官的某些特定的功能，如分泌，收缩等。目前已培养成功的类器官包括：脑、肺、肝、肾、前列腺、胰腺、结直肠等。癌症一直是影响全球人体健康的最主要的问题，虽然近几年癌症的研究和治疗取得很多突破性的成果，包括免疫检查点的发现，CAR-T免疫疗法的诞生。但是随着越来越多的肿瘤药物及治疗方法的面世，临床病人可供选择药物也越来越多，基于患者的个体化治疗越来越受到医生和患者的重视。传统的肿瘤筛选模型主要是2D肿瘤细胞系模型，该模型虽然培养简单建模速度快，但由于缺乏肿瘤微环境导致肿瘤基因表达改变，不能很好的反应生理情况下肿瘤的生长，因此基于3D培养的肿瘤类器官能够为肿瘤的研究和治疗提供可靠的模型。目前肿瘤类器官的模型大多停留在实验阶段，很难进行高通量的药物筛选，同时不同大小的类器官在一定程度上影响实验结果的准确性。微流控技术是一项在微米尺度空间对流体进行操控的技术，以其高通量、高灵敏度、低消耗等优点备受研究者关注，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。微流控技术主要应用流体的层流和液滴现象。层流与湍流相对应，是指流体的层状流动，其流线与管壁相互平行。在粘性力远远大于惯性力，或雷诺数小于3000时，层流就会出现。当几相不同颜色的流体从不同的入口进入同一个微通道时，即使它们互溶，也会形成层次分明的多相平行流动。利用层流的这种几何规律性，可以实现材料、化学环境和细胞在微通道中的有序排布。微流控能够以非常高的通量制备高度单分散性的液滴乳液。常见的微通道结构为T型和ψ型。在某些情况下，含有不同高分子聚合物的水相液体在微流控通道中也会形成不互溶的液滴。CN109136185A公开了一种类脑器官器的制备方法和应用，具体是提供干细胞在体外分化发育形成三维结构且具有血管结构的类皮层组织结构(corticalorganoid)的方法和培养条件。而且随着持续的培养还能够建立具有神经元功能和成熟神经环路连接的3D体系，使其更加接近于大脑皮层从胚胎期神经发生到出生后突触发育和功能建立的发育过程。用此培养系统培养的产品可以应用于疾病研究和药物筛选等。CN108486035A公开了一种三维类器官的液滴培养方法，涉及一种三维类器官的液滴培养方法以及其在生物医学中的应用。将移液枪头与常规细胞培养方法相结合，利用移液枪头形成球形构象的液滴作为培养载体，在其中培养制备毫米级的三维类器官组织。通过对移液枪头剪截位置、注入液体体积、液滴与截面间的接触角角度等因素的筛选分析，获得了比较理想的类器官液滴培养条件。但是这种方法无法保证均一性，操控性较差。因此，如何开发一种制备类器官的形状大小均一、达到高通量生产并使得应用临床时抗癌药物预测准确度高对于类器官的应用具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种类器官球体的制备方法，以解决现有方法制备类器官存在的无法高通量制备，生成的类器官形状大小不均一，影响预测结果的准确性和可重复性的问题。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种类器官球体的制备方法，所述制备方法包括：所述制备方法包括：将含细胞的基质胶和氟油分别通入到三通装置中得到细胞球体，经过培养后形成类器官球体。本专利技术提供的类器官球体的制备方法，利用微流控的方法生成单分散的生物材料类器官，实现了高通量生产，类器官的大小、形状和结构可控并且均一，相比于2D肿瘤敏感性预测模型，本专利技术制备的类器官结合了肿瘤微环境因素预测结果更准确；相比于PDX小鼠肿瘤敏感性预测模型，本专利技术的建模周期更短，费用更低；相比于普通的基因测序，本专利技术临床预测率更高。目前抗肿瘤药物繁多，同时肿瘤存在异质性以及患者对于药物敏感性差异，导致病人无法得到最优的个体化治疗。现有的抗癌药物敏感性测试模型包括2D肿瘤细胞模型和PDX模型，2D细胞肿瘤细胞模型由于缺失了肿瘤组织微环境，对抗癌药物的预测准确率较低，而PDX小鼠模型周期过长，成本太高，成功率太低，且存在物种差异性而导致预测不准确。此外，传统的肿瘤类器官制作过程无法做到高通量的应用，无法应用于大量的药物筛选，同时生成的类器官形状大小不一，一定程度上影响结果的准确性和可重复性。优选地，所述含细胞的基质胶由细胞与基质胶混合后制备得到。优选地，所述细胞的个数为1.0×105～1.0×107个；，例如可以是1.0×105个、1.0×106个、2.0×106个、3.0×106个、4.0×106个、5.0×106个、1.0×107个等，优选为2.0×106个。在本专利技术中，细胞的个数不能过高或者过低，如果细胞个数过低，则细胞几乎不能够生长；如果细胞的个数过高，则会使得形成的球体易爆。优选地，所述细胞为原代细胞。本专利技术所述原代细胞经过提取得到。原代细胞提取方法：通过手术或穿刺得到的癌组织或动物组织，4度条件下剪切成1mm左右的小块，利用I型胶原酶在37度细胞培养箱中消化1小时，利用100μm滤网过滤细胞，利用红细胞裂解液裂解红细胞，离心并用培养基重悬细胞，细胞计数后备用。优选地，所述基质胶的体积为10～1000μL，例如可以是10μL、50μL、100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL、450μL、500μL、550μL、600μL、650μL、700μL、750μL、800μL、850μL、900μL、950μL或1000μL等，优选为100μL。优选地，所述混合的温度为2～8℃，例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等，优选为4℃。在本专利技术中，氟油能够更好的产生液滴现象，对于含细胞的基质胶能够产生良好的液液界面张力和剪切力作用，使得含细胞的基质胶流体形成高度均一的间断流，而氟油与含细胞的基质胶会形成乳液，通过这种微流控的方法，自下而上的将类器官剪切包裹成球体，使得最终可形成类器官球体。优选地，所述通入的方法为注射。本专利技术所述通入的方法不仅限于注射，任何可以将两种液体加入到三通中的方法均适用于本专利技术。优选地，所述注射的方法为：将含细胞的基质胶和氟油分别置于两个注射装置中，然后分别通过管道注射进三通装置中。在本专利技术中，注射装置一般通过管道与三通装置本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种类器官球体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将含细胞的基质胶和氟油分别通入到三通装置中得到细胞球体，经过培养后形成类器官球体。

【技术特征摘要】
1.一种类器官球体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将含细胞的基质胶和氟油分别通入到三通装置中得到细胞球体，经过培养后形成类器官球体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含细胞的基质胶由细胞与基质胶混合后制备得到。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述细胞的个数为1.0×105～1.0×107个；优选为2.0×106个；优选地，所述细胞为原代细胞。4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述基质胶的体积为10～1000μL；优选为100μL；优选地，所述混合的温度为2～8℃；优选为4℃。5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述通入的方法为注射。6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述注射的方法为：将含细胞的基质胶和氟油分别置于两个注射装置中，然后分别通过管道注射进三通装置中。7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述含细胞的基质胶的流速为1～100μL/min；优选为20μL/min；优选地，所述氟油的流速为1～500μL/min；优选为50μL/min。8.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：马少华，蒋盛威，
申请(专利权)人：清华伯克利深圳学院筹备办公室，
类型：发明
国别省市：广东,44