高产重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法以及新型重组蛋白技术

本发明专利技术提供在植物贮藏器官中高产重组蛋白的方法以及ＧＬＰ－１衍生物。使用一种载体，通过转化得到高产重组蛋白的植物贮藏器官。其中所述载体含有重组蛋白的基因、细胞分裂素相关基因、抗药性基因以及具有脱离能力的ＤＮＡ因子，且细胞分裂素相关基因和抗药性基因存在于与具有脱离能力的ＤＮＡ因子的联动的位置，在植物的贮藏器官中表达的重组蛋白存在于与具有脱离能力的ＤＮＡ因子的不联动的位置。通过上述方法生产ＧＬＰ－１，并提供对酶的分解作用稳定的衍生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及高产重组蛋白的植物的贮藏器官的生产方法、以及肽酶抗性人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的新型衍生物及其利用。本专利技术中，“重组蛋白”包含“重组肽和重组蛋白”(以下表示为“重组蛋白”)。
技术介绍
利用基因工程技术的药物、临床检查药物、工业原料的生产已经在实际的产业方面成就了很大的贡献，其中，以微生物或哺乳类培养细胞为宿主的物质生产系统得到特别广泛应用。但是，培养这些细胞时，必须有无菌环境完善的培养设备或培养基等，并且，不可避免地要消耗石油能源，因此成本高。另外，使用哺乳类细胞作为宿主，则不可避免会有对人体有害的病毒混入的风险。因此，作为价廉、安全的物质生产系统，人们开发了使用转基因植物的物质生产系统，以此代替通过微生物或哺乳类细胞的培养进行的物质生产。例如，迄今为止已报道的有生产生物降解性聚酯等高分子化合物(例如日本特开2002-262886号公报)、疫苗(例如G.Jaeger等.，Eur.J.Biochem.259，426，1999)或乳铁蛋白(D.Chong等.，Transgenic.Res.9，71，2000)等蛋白、脑啡肽(日本特开2000-106890号公报)等肽的转基因植物的制备。作为转基因植物，如果可以在该植物的可食用部分例如大豆或水稻的种子、蔬菜的叶等生产对人体有益的功能性物质，则无须经过目标物质的提取步骤，即可直接经口摄入人体。并且如果是种子，还无需用冷藏装置完备的设备进行保存或运输，可在室温下稳定地长期保存。另外，提取目标物质时，种子与叶不同，几乎没有酚性物质的混入，因此容易纯化。因此可以认为种子是理想的生产目标基因产物的器官，目前为止，已有例如制备生产大豆球蛋白(T.Katsube等.，Plant.Physiol.120，1063，1999)等蛋白、(1，3-1，4)-β-葡聚糖酶(H.Horvath等.，Proc.Nathl.Acad.Sci.USA.，97，1914，2000)等酶、脑啡肽(D.Chong等.，Transgenic.Res.9，71，2000)等肽的种子的报告。但是，通过转基因植物的物质生产系统与目前作为主流的微生物或哺乳类细胞培养系统比较，在具有上述优异特性的另一面，也有产率低、特别是由植物贮藏器官进行的生产效率差的问题。为解决该问题，人们考虑了各种增强转基因植物中物质生产能力的方案。例如，为了改善贮藏其器官之一的种子的物质生产能力，从提高导入的目标基因的表达或基因产物的蓄积的观点考虑，人们将精力集中于以下的研究利用在种子中强烈表达的种子贮藏蛋白的启动子(例如T.Katsube等.，Plant.Physiol.120，1063，1999)、将该启动子同与之作用并使表达增强的转录因子结合使用(例如D.Yang等.，Proc.Nathl.Acad.Sci.USA.，98，11438，2001)、插入5’非翻译区(例如日本特开2002-58492号公报)、使基因中的C+G含量最佳(H.Horvath等.，Proc.Nathl.Acad.Sci.USA.，97，1914，2000)、向内质网附加核输送信号(例如日本特开2000-504567号公报)等。还有报告指出使用缺失种子贮藏蛋白的突变体作为导入外源基因的植物体，则外源基因产物在种子中的生产量提高(日本特开2002-58492号公报)。但仅凭这些改良，不足以显示种子中的物质生产能力得到了增强，人们希望开发出新的方法。另一方面，已知GLP-1(胰高血糖素样肽-1)是因摄取食物而由消化管分泌、在胰脏中发挥功效，刺激糖依赖性胰岛素的分泌的激素。II型糖尿病患者中，虽然可以保持对该GLP-1的应答性，但量不足。GLP-1制剂的开发作为补充GLP-1的不足部分的胰岛素分泌促进剂，有望应用于糖尿病治疗药。但是，GLP-1的活性本体是GLP-1(7-36)的酰胺化物或GLP-1(7-37)的多肽，如果口服摄取GLP-1，则在消化管内被消化酶消化、分解，不能充分吸收。因此，目前临床上尝试通过输液进行静脉内注射或皮下注射。并且有报道指出，GLP-1也可被存在于血液中或组织中的二肽酰肽酶IV(DPP-IV)分解，活性半衰期只有1-2分钟，非常短，容易由肾脏排出，在血液中的半衰期在5分钟以内，这些成为临床应用的瓶颈。因此人们研究开发难以被分解、半衰期长的GLP-1衍生物。例如有第8位氨基酸置换衍生物(Diabetologia41，271-278，1998、Biochem40，2860-2869，2001)、N末端和C末端氨基酸的修饰产物(WO9808871等)、将第34位置换为Arg并向第26位Lys导入亲油性基团的衍生物(WO0007617)、以及整个序列都有氨基酸置换的衍生物(WO9943705、WO9111457)等。另外还进行了皮下吸收缓慢的缓释型注射剂，或者具有类GLP-1激动活性、在血液中的半衰期长、来自蜥蜴的合成Exendin-4的注射剂。但是这些都是注射剂，考虑到患者的负担，人们希望开发由注射以外的途径给药的新型GLP-1衍生物。本专利技术的课题在于提供高产重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法、通过该方法生产的高产重组蛋白的植物贮藏器官、以及肽酶抗性人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的新型衍生物及其利用。即，为了增强转基因植物的贮藏器官中的物质生产，进行了上述的各种尝试。但是，为了将生产可用作药物等的重组蛋白的植物贮藏器官作为食物摄取，使其在体内发挥充分的功能，有必要开发更高产重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法，同时，由植物中提取重组蛋白并加工成药物或功能性食品时，可以在这些贮藏器官中高产重组蛋白，这在成本方面是很重要的。因此，本专利技术的目的之一在于提供在转基因植物中高产重组蛋白的贮藏器官的新型生产方法。如果选择GLP-1作为通过上述方法在植物贮藏器官中高产的重组蛋白，则只是象平常饮食那样摄取果实或米等，就有望获得糖尿病的治疗效果。但是，如上所述，该天然型GLP-1在消化管内被消化酶消化、分解，因此无法以口服的方式稳定给药，因此目前的现状是尚未有除注射以外的有效的给药方式。因此，人们考虑如果通过一些方法使GLP-1不被消化而通过胃，就可以在小肠被吸收了。不过，吸收时，GLP-1必须以单体的形式存在。此时，天然型GLP-1也会被胰蛋白酶等酶分解而失活。并且，天然型GLP-1即使被吸收了，其后也会被二肽酰肽酶IV分解，作用无法持续。因此，为了通过口服GLP-1来获得药理效果，必须设计一种通过氨基酸置换使其难以被胰蛋白酶或二肽酰肽酶IV分解、具有持续性活性的GLP-1衍生物。因此，本专利技术的另一目的在于提供对胰蛋白酶等消化酶具有抗性的可口服的新型GLP-1衍生物，进一步优选同时对二肽酰肽酶IV具有抗性的新型GLP-1衍生物。由此即可获得在作为食物摄取时可被吸收、显示药理效果的GLP-1衍生物。
技术实现思路
本专利技术人对于转基因植物中高产重组蛋白的贮藏器官的生产方法进行了深入地研究，结果发现通过构建一种载体，将该载体导入细胞中，由该导入有基因的植物的细胞再分化成转化体，由该再分化的转化体获得贮藏器官，由此可以在转基因植物中生产高产重组蛋白的贮藏器官，从而完成了本专利技术，其中所述载体含有在植物的贮藏器官中表达的重组蛋白的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
高产重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法，其特征在于：该方法包含以下步骤（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）：　　　　（Ａ）构建一种载体，将该载体导入细胞中的步骤，其中所述载体含有在植物的贮藏器官中表达的重组蛋白的基因、细胞分裂素相关基因、抗药性基因和具有脱离能力的ＤＮＡ因子，且细胞分裂素相关基因和抗药性基因存在于与具有脱离能力的ＤＮＡ因子联动的位置，在植物贮藏器官中表达的重组蛋白的基因存在于与具有脱离能力的ＤＮＡ因子不联动的位置；　　　　（Ｂ）将通过上述（Ａ）导入了载体的植物细胞在添加药物的培养基和不添加药物的培养基上进行培养，由此再分化为转化体的步骤；　　　　（Ｃ）从通过上述（Ｂ）再分化的转化体中获得植物贮藏器官的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：杉田耕一，S笠原，海老沼宏安，高岩文雄，城森孝仁，林祐二，田下聪，小原由香里，
申请(专利权)人：独立行政法人农业生物资源研究所，日本制纸株式会社，株式会社三和化学研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]