一种用于卵巢组织体外培养的胶原材料及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于卵巢组织体外培养的胶原材料及其制备方法和应用。一种胶原材料制备方法：取牛腱子肉，去除脂肪和肌肉，得到肌腱组织，用水清洗；置于丙酮中浸泡；置于水中浸泡并清洗；置于NaOH溶液中浸泡；置于水中浸泡并清洗；冷冻干燥，得到干燥组织；溶于醋酸溶液；转移到透析袋在水中进行透析；收集透析袋内的整个体系，冷冻干燥，得到干粉状胶原材料。本发明专利技术还保护一种负载CBD‑bFGF蛋白的胶原材料：取干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料；将CBD‑bFGF蛋白负载于凝胶状胶原材料。将负载CBD‑bFGF蛋白的胶原材料用于体外培育卵巢，可促进卵巢原始卵泡激活，促进雌二醇的表达。

A collagen material for ovarian tissue culture in vitro and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种用于卵巢组织体外培养的胶原材料及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种用于卵巢组织体外培养的胶原材料及其制备方法和应用。
技术介绍
卵巢在女性体内同时执行内分泌和生殖功能，对生殖和维持正常性征具有重要意义。临床利用卵巢移植可以治疗卵巢切除后的不良反应、卵巢早衰的不良反应及绝经期妇女的不良反应。例如，恶性肿瘤病人在接收化疗前可以将卵巢皮质冻存，化疗完成后待其病情缓解有能力生育后代时，再将之前冷冻的卵巢组织解冻和体外培养,结合IWM、IWF技术可以为她们提供获得亲生后代的机会。卵巢组织体外培养可以降低异体卵巢移植的免疫原性。因此，合适的卵巢组织体外培养方法对于卵巢相关疾病的治疗具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于卵巢组织体外培养的胶原材料及其制备方法和应用。本专利技术首先保护一种胶原材料的制备方法，包括如下步骤：(1)取牛腱子肉，去除脂肪和肌肉，得到肌腱组织，用水清洗；(2)取完成步骤(1)的组织，置于丙酮中浸泡；(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；(4)取完成步骤(3)的组织，置于NaOH溶液中浸泡；(5)取完成步骤(4)的组织，置于水中浸泡并清洗；(6)取完成步骤(5)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；(7)取步骤(6)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液；(8)将完成步骤(7)的整个体系转移到透析袋在水中进行透析；(9)完成步骤(8)后，收集透析袋内的整个体系，然后进行冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料。步骤(1)中，所述水为去离子水。步骤(2)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(2)中，浸泡时间可为1小时-15小时，具体可为10小时。步骤(2)中，每1小时更换新的丙酮。步骤(3)中，所述水为去离子水。步骤(3)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(3)中，浸泡并清洗可为“每10分钟-30分钟换水，共换水8次-20次”，具体可为“每20分钟换水，共换水9次，最后一次换水20分钟后完成本步骤”。步骤(4)中，所述NaOH溶液为NaOH水溶液。步骤(4)中，NaOH溶液为0.5M-4MNaOH溶液，具体可为2MNaOH溶液。步骤(4)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(4)中，浸泡时间可为5分钟-60分钟，具体可为20分钟。步骤(5)中，所述水为去离子水。步骤(5)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(5)中，浸泡并清洗可为“每3分钟-10分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每5分钟换水，共换水19次，最后一次换水5分钟后完成本步骤”。步骤(6)中，所述冷冻干燥的时间可为12小时-72小时，具体可为36小时。步骤(7)中，所述醋酸溶液为醋酸水溶液。步骤(7)中，醋酸溶液为0.05M-1M醋酸溶液，具体可为0.5M醋酸溶液。步骤(7)中，干燥组织与醋酸溶液的配比为“1g-5g：100ml-500ml”，具体配比可为“1g-5g：150ml”或“3g：100ml-500ml”，具体配比可为“3g：150ml”。步骤(7)中，醋酸溶液为预冷的醋酸溶液。所述预冷的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(7)中，溶于醋酸溶液的实现方式可为“2℃-16℃搅拌24小时-72小时”，具体可为“4℃搅拌48小时”。步骤(8)中，所述透析袋的截留分子量为3000Da-100kDa，具体可为50kDa。步骤(8)中，所述水为去离子水。步骤(8)中，透析的时间可为5天-15天，具体可为10天。步骤(8)中，透析过程中每天换水，具体可每天换水3次。步骤(8)中，透析的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(9)中，所述冷冻干燥的时间可为12小时-72小时，具体可为36小时。所述方法还包括如下步骤(10)：取步骤(9)得到的干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料。步骤(10)中，溶剂可为生理盐水或磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7-8的磷酸盐缓冲液，具体可为pH7.4的PBS缓冲液。步骤(10)中，干粉状胶原材料与溶剂的配比可为“1g-4g：100ml”，具体可为“3g：100ml”。以上任一所述方法制备得到的干粉状胶原材料也属于本专利技术的保护范围。以上任一所述方法制备得到的凝胶状胶原材料也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护一种负载CBD-bFGF蛋白的胶原材料，其制备方法包括如下步骤：①取所述干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料；②将CBD-bFGF蛋白负载于所述凝胶状胶原材料。干粉状胶原材料与CBD-bFGF蛋白的配比为“1mg干粉状胶原材料：0.02μg-10μgCBD-bFGF蛋白”，具体可为“1mg干粉状胶原材料：0.1μg-3.33μg蛋白”，更具体可为“1mg干粉状胶原材料：0.1μg蛋白”或“1mg干粉状胶原材料：3.33μg蛋白”。溶剂可为生理盐水或磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7-8的磷酸盐缓冲液，具体可为pH7.4的PBS缓冲液。干粉状胶原材料与溶剂的配比可为“1g-4g：100ml”，具体可为“3g：100ml”。本专利技术还保护一种制备负载CBD-bFGF蛋白的胶原材料的方法，包括如下步骤：①取所述干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料；②将CBD-bFGF蛋白负载于所述凝胶状胶原材料。干粉状胶原材料与CBD-bFGF蛋白的配比为“1mg干粉状胶原材料：0.02μg-10μgCBD-bFGF蛋白”，具体可为“1mg干粉状胶原材料：0.1μg-3.33μg蛋白”，更具体可为“1mg干粉状胶原材料：0.1μg蛋白”或“1mg干粉状胶原材料：3.33μg蛋白”。溶剂可为生理盐水或磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7-8的磷酸盐缓冲液，具体可为pH7.4的PBS缓冲液。干粉状胶原材料与溶剂的配比可为“1g-4g：100ml”，具体可为“3g：100ml”。本专利技术还保护所述负载CBD-bFGF蛋白的胶原材料在制备产品中的应用；所述产品的功能为培养卵巢和/或卵巢组织。所述培养具体可为体外培养。本专利技术还保护CBD-bFGF蛋白和胶原材料在制备产品中的应用；所述产品的功能为培养卵巢和/或卵巢组织；所述胶原材料为所述干粉状胶原材料或所述凝胶状胶原材料。所述培养具体可为体外培养。本专利技术还保护一种用于培养卵巢和/或卵巢组织的产品，为如下(a)或(b)：(a)包括所述负载CBD-bFGF蛋白的胶原材料的产品；(b)包括CBD-bFGF蛋白和胶原材料的产品；所述胶原材料为所述干粉状胶原材料或所述凝胶状胶原材料。所述培养具体可为体外培养。以上任一所述体外培养具体可为37℃培养48小时。以上任一所述CBD-bFGF蛋白，为如下(c1)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)、(c6)或(c7)。(c1)包括如下两个元件的蛋白质：胶原结合肽、人源bFGF蛋白；(c2)自上游至下游依次包括如下两个元件的蛋白质：胶原结合肽、人源bFGF蛋白；(c3)包括如下三个元件的蛋白质：胶原结合肽、连接肽、人源bFGF蛋白；(c4)自上游至下游依次包括如下三个元件的蛋白质：胶原结合肽、连接肽、人源bFGF蛋白；(c5)包括如下四个元件的蛋白质：His6标签、胶原结合肽、连接肽、人源bFGF蛋白；(c6)自上游至下游依次包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胶原材料的制备方法，包括如下步骤：(1)取牛腱子肉，去除脂肪和肌肉，得到肌腱组织，用水清洗；(2)取完成步骤(1)的组织，置于丙酮中浸泡；(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；(4)取完成步骤(3)的组织，置于NaOH溶液中浸泡；(5)取完成步骤(4)的组织，置于水中浸泡并清洗；(6)取完成步骤(5)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；(7)取步骤(6)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液；(8)将完成步骤(7)的整个体系转移到透析袋在水中进行透析；(9)完成步骤(8)后，收集透析袋内的整个体系，然后进行冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料。

【技术特征摘要】
1.一种胶原材料的制备方法，包括如下步骤：(1)取牛腱子肉，去除脂肪和肌肉，得到肌腱组织，用水清洗；(2)取完成步骤(1)的组织，置于丙酮中浸泡；(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；(4)取完成步骤(3)的组织，置于NaOH溶液中浸泡；(5)取完成步骤(4)的组织，置于水中浸泡并清洗；(6)取完成步骤(5)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；(7)取步骤(6)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液；(8)将完成步骤(7)的整个体系转移到透析袋在水中进行透析；(9)完成步骤(8)后，收集透析袋内的整个体系，然后进行冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤(10)：取步骤(9)得到的干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料。3.权利要求1所述方法制备得到的干粉状胶原材料。4.权利要求2所述方法制备得到的凝胶状胶原材料。5.一种负载CBD-bFGF蛋白的胶原材料，其制备方法包括如下步骤：①取权利要求3所述的干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料；②将CBD-bFGF蛋白负载于所述凝胶状胶原材料；所述CBD-bFGF蛋白为权利要求10所述的蛋白质。6.一种制备负载CBD-bFGF蛋白的胶原材料的方法，包括如下步骤：①取权利要求3所述的干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料；②将CBD-bFGF蛋白负载于所述凝胶状胶原材料；所述CBD-bFG...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴建武，赵燕南，陈冰，侯祥林，唐卫华，郑玉，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11