一株耐酸发酵乳杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株耐酸发酵乳杆菌及其应用，属于发酵工程技术领域。该菌株于2016年9月5日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为12934。该菌株对酸具有很好的耐受性，在pH为3.85～4.40的条件下生长良好，经液态发酵培养，该菌株可代谢糖类物质产生乳酸，其乳酸总量达到27.37g/L；在酿醋过程的封醅阶段添加该菌株，可提高食醋中乳酸含量，改善食醋的口感和风味。

A Lactobacillus acidophilus fermentation strain and its application

【技术实现步骤摘要】
一株耐酸发酵乳杆菌及其应用
本专利技术属于发酵工程
，具体涉及一株耐酸发酵乳杆菌以及使用该菌株将糖类物质转化为乳酸的方法。
技术介绍
乳酸是许多传统发酵食品的重要呈味物质，如食醋、白酒、泡菜等。对于食醋而言，乳酸是其中含量最高的不挥发性酸，部分食醋还将不挥发酸含量作为划分食醋等级的一个重要指标。因此，提高乳酸的含量对于柔和食醋的酸味、降低醋酸的刺激感和提高食醋等级等具有重要作用，同时它也是调节食醋pH、延长其保质期的关键物质之一。食醋中的乳酸主要由醋酸发酵过程中的乳酸菌代谢生成，其中以乳酸杆菌属(Lactobacillus)为主，包括瑞士乳酸杆菌(L.helveticus)、哈氏乳酸杆菌(L.hamsteri)、桥乳酸杆菌(L.pontis)和面包乳酸杆菌(L.panis)等。在醋酸发酵前期，乳酸菌在酿醋微生物群落中占主导，但由于体系中乳酸、乙酸等代谢产物的积累，醋醅中总酸含量升高，大多数乳酸菌由于不耐受高酸而逐渐消亡，醋酸菌逐渐成为体系中的优势菌群，由于发酵后期碳源不足，乳酸会被部分微生物消耗掉，这是造成食醋中主要的不挥发酸乳酸含量降低的主要原因之一。因此，筛选可以发酵糖产乳酸，且具有良好耐酸性能(尤其是醋酸)的乳酸菌菌株，对于生产中提高食醋乳酸含量具有重要的实际意义。目前未见报道采用本专利技术所述的耐酸发酵乳杆菌用于食醋生产中强化乳酸产量。
技术实现思路
鉴于上述生产中的技术问题，本专利技术旨在通过筛选一株耐酸乳酸菌，并将其利用在食醋酿造过程中，提高食醋中不挥发酸在总酸中的占比，改善食醋的口感、风味与品质。本专利技术首先提供了一株耐酸发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，该菌株于2016年9月5日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.12934，分类命名为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)LFE02。获取所述菌株的16SrRNA基因序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其种属，该菌株16SrRNA基因序列全长为1541bp，与其具有最高同源性的菌株为Lactobacillusfermentum(GenBank登录号：KF030758.1)，16SrRNA基因序列见SEQIDNO：l。所述菌株可利用的主要糖类物质包括D-葡萄糖、D-果糖、L-海藻糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖和蔗糖。所述菌株在厌氧条件下，静置培养可代谢糖类物质产生乳酸。所述发酵生产乳酸的工艺为：种子/液态发酵培养基：①葡萄糖40g/L，胰蛋白胨20g/L，牛肉膏20g/L，酵母粉10g/L，乙酸钠10g/L，柠檬酸氢二铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，七水合硫酸镁1.16g/L，一水合硫酸锰0.38g/L，吐温802mL/L，pH3.85～4.40，121℃下灭菌20min；②L-半胱氨酸盐酸盐1g/L，121℃下灭菌20min。①与②在无菌条件下等体积混合；种子培养方法：50mL三角瓶装液量10mL，36℃厌氧静置培养4天；发酵培养方法：以1～8％接种量将种子液接入发酵培养基，250mL三角瓶装液量100mL，厌氧条件下，35～37℃静置培养。本专利技术提供了一种所述菌株的应用，采用上述发酵工艺，该菌株生产的乳酸含量可达9.04±0.11g/L。本专利技术的一种实施方式中，增加培养基中葡萄糖含量，该菌株发酵的乳酸产量可提高至27.37±0.13g/L。本专利技术的一种实施方式中，所述葡萄糖含量为50g/L。本专利技术还提供了一种所述菌株的应用，在固态食醋酿造的封醅阶段加入所述发酵乳杆菌，同时补加醋醅质量2～5％的蔗糖，可提高食醋中乳酸的含量和不挥发酸比例，使食醋口感更加柔和。本专利技术还提供了一种所述菌株的应用，在液态白米醋酿造过程中，醋酸菌发酵结束后，补加醋液质量2～5％的蔗糖，加入所述发酵乳杆菌，可提高白米醋中乳酸含量，改善白米醋的口感和风味。本专利技术从醋醅中筛选得到一株具有较好耐酸能力的产乳酸菌株，经鉴定为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)。该菌株可在pH3.85～4.40的条件下良好生长，同时可代谢糖类物质产生乳酸，其乳酸产量可达到27.37±0.13g/L。在食醋酿造过程的封醅阶段添加该菌株，可提高食醋中乳酸产量，改善食醋的口感和风味。具体实施方式实施例1：产乳酸和耐酸菌株的筛选从镇江香醋醋醅中取10g样品装入混有玻璃珠和90mL无菌水的500mL三角瓶中，在36℃摇床上以115rpm振荡30min，然后取菌悬液1mL用无菌生理盐水10倍梯度稀释，以10-3～10-6梯度稀释样涂布分离培养基平板，36℃厌氧静置培养7～14天；将平板上丰厚的菌落经分离纯化后接入斜面培养基，36℃培养7天，4℃保藏；同时将菌落接入液体培养基中，36℃培养7天后，采用高效液相色谱法(HPLC)测定发酵液中乳酸的含量，从而筛选得到耐酸的产乳酸菌株。分离/斜面培养基：①葡萄糖40g/L，胰蛋白胨20g/L，牛肉膏20g/L，酵母粉10g/L，乙酸钠10g/L，柠檬酸氢二铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，七水合硫酸镁1.16g/L，一水合硫酸锰0.38g/L，吐温802mL/L，琼脂粉40g/L，pH3.6～6.6，121℃下灭菌20min；②L-半胱氨酸盐酸盐1g/L，121℃下灭菌20min。①与②在无菌条件下等体积混合后制得分离/斜面培养基。液体培养基：①葡萄糖40g/L，胰蛋白胨20g/L，牛肉膏20g/L，酵母粉10g/L，乙酸钠10g/L，柠檬酸氢二铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，七水合硫酸镁1.16g/L，一水合硫酸锰0.38g/L，吐温802mL/L，pH3.6～6.6，121℃下灭菌20min；②L-半胱氨酸盐酸盐1g/L，121℃下灭菌20min。①与②在无菌条件下等体积混合后制得液体培养基。HPLC测定具体方法如下：①样品的预处理方法准确量取2mL发酵上清液，将培养液离心(12000rpm，5min)获得上清液，分别加入800μL硫酸锌(300g/L)和800μL亚铁氰化钾(106g/L)，振荡混匀，离心。取上清液用0.22μm水系微孔滤膜过滤后为待测样品。与此同时，以乳酸标准品为外标绘制乳酸的标准曲线。②HPLC测定条件如表1所示。表1HPLC测定乳酸的条件根据HPLC结果，得到一株耐酸(pH3.85)且同时产乳酸的菌株，乳酸产量为9.04±0.11g/L，于4℃置于斜面培养基中保藏以备进一步分析。实施例2：产乳酸和耐酸菌株的分子鉴定纯化筛选得到的菌株，取指数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，采用细菌基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。采用细菌通用引物P0/P6扩增其16SrRNA基因全长序列，具体如下：P0:5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’P6:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’①反应体系(50μL)②反应程序PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离检验，电压约11V/cm，电泳时间20min。PCR扩增产物的纯化按上海生工生物技术公司的小量胶回收PCR产物纯化试剂盒说明进行，测序由上海生工生物技术公司完成。获得的细菌16SrRNA基因序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株耐酸发酵乳杆菌，其特征为，该菌株于2016年9月5日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12934，分类命名为发酵乳杆菌((Lactobacillus fermentum)LFE02。

【技术特征摘要】
1.一株耐酸发酵乳杆菌，其特征为，该菌株于2016年9月5日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.12934，分类命名为发酵乳杆菌((Lactobacillusfermentum)LFE02。2.如权利要求1所述的菌株，其特征为，发酵乳杆菌((Lactobacillusfermentum)CGMCCNO.12934可耐受pH至3.85的酸性环境。3.如权利要求1所述的菌株，其特征为，发酵乳杆菌((Lactobacillusfermentum)CGMCCNO.12934可代谢糖类物质产生乳酸；所述糖类物质包括D-葡萄糖、D-果糖、L-海藻糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖和蔗糖。4.如权利要求1所述的菌株，其特征为，发酵乳杆菌((Lactobacillusfermentum)CGMCCNO.12934，其16SrRNA基因序列具有SEQIDNO：l所示的序列。5.如权利要求1所述的菌株，其特征为，发酵乳杆菌((Lactobacillusfermentum)C...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴丽娟，许正宏，邓永建，陆震鸣，张晓娟，史劲松，余永建，李信，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32