公开了一种稳定聚合物形式的新型重组蛋白UK114，用于治疗、诊断和预防恶性实体和全身肿瘤。
A novel recombinant protein UK 114 in stable polymer form is used for the treatment, diagnosis and prevention of malignant solid and systemic tumors.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定聚合物形式的新型重组蛋白UK114用于治疗、诊断和预防恶性实体和全身性肿瘤本专利技术涉及稳定聚合物形式的重组YjgF/YER057c/UK114RID蛋白(YjgF/YER057c/UK114)，用于治疗、诊断和预防恶性实体和全身肿瘤。现有技术称为YjgF/YERO57c/UK114的蛋白质家族在各种原核生物和真核生物中高度保守，已经形成了旨在调查所述蛋白质的结构和功能特征的许多研究的主题(Bartorelli等人，J.Tumor和MarkerOncology，1994,9,37；LambrechtJA等人，J.Biol.Chem.，2010,285,34401-34407；LambrechtJA等人，J.Biol.Chem.，2012,287,3454-3461；MistinieneE等人，BioconjugateChem.2003,14,1243-1252；DhawanL等人，Mol.Cell.Biol.，2012,32,3768-3775；FlynnJM等人，Mol.Microbiol.，2013，89(4)751-759；ErnstDC等人，J.Bacteriology，2014,196(18)，3335-3342；NiehausTD等人，BMCGenomics，2015,16,382)。UK114属于YjgF/YER057c/UK114家族。该家族成员的共同点是它们的生物活性，尤其是2-氨基丙烯酸的脱氨酶活性(参见Lambrect等人，2012)。所述活性定义YjgF/YER057c/UK114家族的所有成员，其首字母缩写为RID。WO9602567描述了含有蛋白质UK114的高氯酸可溶性山羊肝脏提取物(称为UK101)的抗肿瘤活性。所述蛋白质具有14.2kDa的分子量和137个氨基酸的序列，如CecilianiF.等人，FEBSLetters，1996,393,147-150所报道的。从与其交叉反应的各种物种和/或蛋白质中分离的天然蛋白质UK114仅存在于正常细胞的细胞质中，而其各种百分比也存在于恶性实体全身性肿瘤细胞的细胞膜中(BartorelliA，等人，IntJOncol.1996Mar；8(3)：543-8.；BussolatiG等人，IntJOncol.1997Apr；10(4)：779-85)。在腺癌中，它在超过80％的肿瘤中表达。重组形式的蛋白质UK114的大肠杆菌表达描述于WO0063368和ColomboI等人(Biochim.Biophys.Acta，1998,1442,49-59)和BurmanJD等人，(BMCStructuralBiology，2007,7,30)，但是，与报道二聚体结构的WO0063368不同，DeriuD等人(ActaCryst.，2003，D59,1676-1678)报道了结晶形式的蛋白质UK114具有三聚体构型。从文献中已知具有单体结构的蛋白质UK114(Oka等人，1995J.Biol.Chem.270：30060-30067)可以以不稳定的二聚体或三聚体形式存在。在实验上，各种物理化学条件，尤其是各种离子和蛋白质变性浓度，可以使二聚体或三聚体蛋白质UK114呈现单体构象，如色谱和质谱分析所证明的。根据Mistiniene等人的研究，重组蛋白UK114(从大肠杆菌获得)在由KCl3M或3M盐酸胍诱导的轻微变性的条件下以单体形式出现，而在0.1MNaCl溶液中，它是三聚体形式。这种结果的可变性是由于三聚体在各种不稳定条件下解离成单体的趋势。在任何情况下，没有描述被认为是三聚体的形式的免疫原性活性，而申请人进行的研究表明，当注射到异种哺乳动物中时，从单体大肠杆菌获得的重组蛋白不产生任何抗体反应。ColomboI.等人(Biochim.Biophys.Acta，1998,1442,49-59)和WO00/63368中公开的重组蛋白质(描述为二聚体和/或三聚体)实际上在还原和非还原条件下都快速分解成单体，因此不能诱导抗体反应。WO00/63368描述了UK114的重组形式，其与天然形式相差单个氨基酸。所要求保护形式的标签的缺失意味着各种纯化步骤，如WO00/63368的实施例中所述。所要求保护的蛋白质是二聚体形式，但在SDS中完全解离成单体，而在非还原条件下，只有90％的蛋白质解离。ColomboI.等人在BiochimicaetBiophysicaActa中描述的形式呈现另外3个氨基酸(VPM)，其源自在N-末端的克隆，并且还解离成单体。当注射到异种哺乳动物中时，所述蛋白质均不产生细胞毒性免疫应答。WO00/63368和Colombo等人还指出该蛋白质被抗UK101提取抗体免疫识别，这是显而易见的，因为单体蛋白质几乎是半抗原(分子量14.2kD)，除了弱的IgG反应外，它不能诱导良好的免疫反应，但是被靶向其抗原决定簇的抗体识别，因为它在WesternBlot中与通过用提取物UK101免疫产生的抗天然UK114(提取)抗体结合，所述提取物UK101(除了分子UK114，其中大部分解离成单体)还含有载体(50kD糖蛋白)。然而，当这些重组蛋白质被注射到哺乳动物体内时，它们不会产生细胞毒性免疫应答，因为尽管它们被认为是二聚体和/或三聚体，但它们很快被转化为单体，这是一种半抗原，因此不是单独免疫原性的。
技术实现思路
现在已经发现，如果将稳定聚合物形式的重组YjgF/YERO57c7/UK114RID蛋白注射到异种动物体内，它会引发针对在恶性实体和全身肿瘤细胞上表达的相同和/或交叉反应抗原的强烈、持久的细胞毒性抗体应答。因此，根据本专利技术的蛋白质可用于治疗、诊断和预防恶性实体和全身性瘤。对各种物种中存在的UK114的同一性的分析证明，与智人(以100％为单位)的同一性在猕猴(Macacamulatta)中为99.3％，在裸鼹鼠(Heterocephalusglaber)中为45.6％。低于86％且高于60％的同一性值适合于本专利技术的目的，因为它们足够异源以刺激抗体应答但具有良好的同一性而能够产生识别肿瘤细胞膜上表达的决定簇的多克隆抗体。表1显示了与人UK114相比所述UK114蛋白的同一性百分比。对各种物种中存在的UK114的同一性的分析证明，与智人(以100％为单位)的同一性在猕猴中为99.3％，在裸鼹鼠中为45.6％。表1BLAST检索根据本专利技术的稳定的聚合重组YjgF/YER057c/UK114RID蛋白(下文称为PRP14)包含三个或更多个单体单元，每个单体单元具有137个氨基酸的序列，因此具有约42.6或更高的分子量。单体单元的优选序列是序列SEQID1：GSHMSSLVRRIISTAKAPAAIGPYSQAVLVDRTIYISGQLGMDPASGQLVPGGVVEEAKQALTNIGEILKAAGCDFTNVVKATVLLADINDFSAVNDVYKQYFQSSFPARAAYQVAALPKGGRVEIEAIAVQGPLTTASL。所述序列，在此作为实例显示，衍生自山羊并且如下所述在合适的载体中在大肠杆菌中表达，其特征在于在N末端比上述序列多四个氨基酸。所述额外的氨基酸是G-S-H-M(甘氨酸-丝氨酸-组氨酸-甲硫氨酸)。已经发现，由于在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.聚合形式的重组YjgF/YER057c/UK 114 RID蛋白，用于治疗、诊断和预防恶性实体和全身性瘤。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.16 IT 1020160001274281.聚合形式的重组YjgF/YER057c/UK114RID蛋白，用于治疗、诊断和预防恶性实体和全身性瘤。2.根据权利要求1所述的蛋白质的用途，其中所述聚合蛋白质包含2至15个单体单元。3.根据权利要求1所述的蛋白质的用途，其中所述蛋白质单体单元具有序列SEQID1。4.根据权利要求1所述的蛋白质的用途，所述蛋白质由大肠杆菌表达。5.根据权利要求1所述的蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：阿尔贝托·巴托雷利库萨尼，
申请(专利权)人：阿尔贝托·巴托雷利库萨尼，
类型：发明
国别省市：摩纳哥,MC
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