贝壳杉烯酸羟化酶制造技术

本发明专利技术涉及具有贝壳杉烯酸13‑羟化酶活性的多肽，该多肽包含氨基酸序列，当与包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示序列的贝壳杉烯酸13‑羟化酶比对时，该氨基酸序列包含对应于位置136、248、336或403的任何氨基酸的至少一个氨基酸的替换，所述位置是参考SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3定义的，其中该多肽与具有贝壳杉烯酸13‑羟化酶活性的参考多肽相比具有一种或多种改变的特性。本发明专利技术的多肽可以在重组宿主中用于产生甜菊醇或甜菊醇糖苷。

Huperenoic acid hydroxylase

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】贝壳杉烯酸羟化酶
本公开涉及具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽以及包含编码这种多肽的序列的核酸。本公开还涉及包含所述核酸的核酸构建体和包含所述核酸或核酸构建体的表达载体。此外，本公开涉及包含所述核酸、核酸构建体或表达载体的重组宿主。本公开还涉及包括使重组宿主发酵的制备甜菊醇或甜菊醇糖苷的方法、能够通过这种方法获得的发酵液以及通过方法获得或从发酵液中获得的甜菊醇糖苷。此外，本公开涉及包含两种或更多种甜菊醇糖苷的组合物，并涉及包含甜菊醇糖苷或组合物的食品、饲料或饮料。此外，本公开涉及将第一甜菊醇糖苷转化为第二甜菊醇糖苷的方法，并且涉及生产具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的方法。
技术介绍
多年生草本植物SteviarebaudianaBert.的叶子积聚大量被称为甜菊醇糖苷的具有强烈甜味的化合物。虽然这些化合物的生物功能尚不清楚，但它们作为替代性高效甜味剂具有商业意义。这些甜的甜菊醇糖苷的功能和感官特性表现为优于许多高效甜味剂的功能和感官特性。此外，研究表明甜菊苷能够降低II型糖尿病患者的血糖水平，并且能够降低轻度高血压患者的血压。甜菊醇糖苷积聚在甜叶菊叶中，其中它们可以占叶干重的10％至20％。甜菊苷和莱鲍迪甙A均是热和pH稳定的，并且适用于碳酸饮料并且可以应用于许多其他食物。甜菊苷比蔗糖甜110与270倍之间，莱鲍迪甙A比蔗糖甜150与320倍之间。此外，莱鲍迪甙D也是在甜叶菊叶中积聚的高效二萜糖苷甜味剂。它可比蔗糖甜约200倍。莱鲍迪甙M是另一种高效二萜糖苷甜味剂。它在某些甜叶菊品种叶中以痕量存在，但已表明其具有优异的味道特征。传统上已从甜叶菊植物中提取了甜菊醇糖苷。在甜叶菊中，(-)-贝壳杉烯酸(赤霉酸(GA)生物合成中的中间体)被转化成四环二萜甜菊醇，其然后经过多步糖基化途径以形成多种甜菊醇糖苷。然而，产率可以是可变的，并且受到农业和环境条件的影响。此外，甜叶菊种植需要大量的土地面积、在收获前的很长时间、密集劳动以及用于提取和纯化糖苷的额外成本。最近，使用发酵工艺生产甜菊醇糖苷的兴趣日益增长。WO2013/110673和WO2015/007748中描述了可用于产生至少甜菊醇糖苷莱鲍迪甙A和莱鲍迪甙D的微生物。此类微生物的进一步改进是令人希望的，以便可以产生更高量的甜菊醇糖苷和/或另外或新的甜菊醇糖苷和/或更高量的特定甜菊醇糖苷和/或具有期望比例的不同甜菊醇糖苷的甜菊醇糖苷的混合物。专利技术概述本公开基于新的贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)多肽的鉴定，即具有KAH活性的新多肽。这些多肽可用于生产适合生产甜菊醇和/或一种或多种甜菊醇糖苷的重组宿主。与表达参考贝壳杉烯酸13-羟化酶的重组宿主相比，这种重组宿主可产生更高量的甜菊醇糖苷和更少量的不期望产物。产生更高量的甜菊醇糖苷和/或更少量的不期望产物可以使甜菊醇糖苷的回收更容易。也可以获得更高的产率。因此，本公开涉及具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽，所述多肽包含氨基酸序列，当与包含SEQIDNO：1(来自A.thaliana的野生型KAH序列)或SEQIDNO：3(KAH4_m4)所示序列的贝壳杉烯酸13-羟化酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于位置：136、248、336或403的任何氨基酸的至少一个氨基酸的替换，所述位置是参考SEQIDNO:1或SEQIDNO:3定义的，并且其中所述多肽与具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的参考多肽相比具有一种或多种改变的特性。本公开还涉及：-具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽，所述多肽包含与SEQIDNO5、7、9、11或13具有至少约95％序列同一性，至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；-核酸，所述核酸包含编码本公开的具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的序列；-包含本公开的核酸的核酸构建体，所述核酸可操作地连接至一个或多个能够指导贝壳杉烯酸13-羟化酶在合适的表达宿主中表达的控制序列；-表达载体，所述表达载体包含根据本公开的核酸或核酸构建体。-包含本公开的核酸、核酸构建体或表达载体的重组宿主；-一种制备甜菊醇或甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括在合适的发酵培养基中发酵本文中公开的重组宿主，并任选地回收所述甜菊醇或甜菊醇糖苷。-能够通过本文公开的制备甜菊醇或甜菊醇糖苷的方法获得的包含甜菊醇糖苷的发酵液；-通过本文公开的制备甜菊醇或甜菊醇糖苷的方法获得的或者从本文公开的包含甜菊醇糖苷的发酵液获得的甜菊醇糖苷；-通过本文公开的制备甜菊醇或甜菊醇糖苷的方法获得的或者从本文公开的包含甜菊醇糖苷的发酵液获得的包含两种或更多种甜菊醇糖苷的组合物；-食品、饲料或饮料，其包含通过本文公开的制备甜菊醇或甜菊醇糖苷的方法获得的甜菊醇糖苷或通过本文公开的制备甜菊醇或甜菊醇糖苷的方法获得的组合物，或者从本文公开的包含甜菊醇糖苷的发酵液获得的组合物；-一种将第一甜菊醇糖苷转化为第二甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括：使所述第一甜菊醇糖苷与本文公开的重组宿主、源自这种重组宿主的无细胞提取物或源自其中的任一种的酶制剂接触；从而将第一甜菊醇糖苷转化为第二甜菊醇糖苷；以及-一种产生贝壳杉烯酸13-羟化酶的方法，所述方法包括在适于产生贝壳杉烯酸13-羟化酶的条件下培养本文公开的宿主细胞，并且任选地，回收贝壳杉烯酸13-羟化酶。附图说明图1示出了导致甜菊醇糖苷生物合成的一些但不是全部的潜在途径的示意图。1图2示出了克隆到含有INT3整合侧翼(允许Y.lipolytica中的同源重组)以及KAH4的启动子-orf-终止子和HygB(编码对潮霉素的抗性)的载体中的编码具有KAH活性的多肽的基因的质粒图谱。序列表的描述SEQIDNO:1列出了来自Arabidopsisthaliana的贝壳杉烯酸13-羟化酶多肽的氨基酸序列。SEQIDNO：2列出了编码来自Arabidopsisthaliana的贝壳杉烯酸13-羟化酶多肽的核苷酸序列，其密码子对被优化用于Yarrowialipolytica中的表达。SEQIDNO：3列出了KAH4_m4多肽的氨基酸序列。SEQIDNO：4列出了编码KAH4_m4多肽的核苷酸序列，其密码子对被优化用于Yarrowialipolytica中的表达。SEQIDNO：5至14描述于表1中。SEQIDNO：15列出了编码来自Yarrowialipolytica的羟甲基戊二酰基-辅酶A还原酶多肽的核苷酸序列，其密码子对被优化用于Yarrowialipolytica中的表达。SEQIDNO：16列出了编码来自Yarrowialipolytica的香叶基香叶基二磷酸合酶多肽的核苷酸序列，其密码子对被优化用于Yarrowialipolytica中的表达。SEQIDNO：17列出了编码来自Mucorcircenelloides的香叶基香叶基二磷酸合酶多肽的核苷酸序列，其密码子被优化用于Yarrowialipolytica中的表达。SEQIDNO：18列出了编码来自Steviarebaudiana的柯巴基焦磷酸合酶多肽的核苷酸序列，其密码子对被优化用于Yarrowialipolytica中的表达。SEQIDNO：19列出了编码来自Steviarebaudiana的贝壳杉烯合酶多肽的核苷酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有贝壳杉烯酸13‑羟化酶活性的多肽，所述多肽包含氨基酸序列，当与包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示序列的贝壳杉烯酸13‑羟化酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于位置136、248、336或403的任何氨基酸的至少一个氨基酸替换，所述位置是参考SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3定义的，并且其中所述多肽与具有贝壳杉烯酸13‑羟化酶活性的参考多肽相比具有一种或多种改变的特性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.08 EP 16202945.81.具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽，所述多肽包含氨基酸序列，当与包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：3所示序列的贝壳杉烯酸13-羟化酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于位置136、248、336或403的任何氨基酸的至少一个氨基酸替换，所述位置是参考SEQIDNO:1或SEQIDNO:3定义的，并且其中所述多肽与具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的参考多肽相比具有一种或多种改变的特性。2.根据权利要求1所述的多肽，其中通过使用EMBOSSNeedle比对方法，使用EBLOSUM62作为替换矩阵，使用缺口开放罚分为10和缺口延伸罚分为0.5将具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的氨基酸序列与SEQIDNO：1或SEQIDNO：3示出的氨基酸序列比对来识别具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽中对应于位置136、248、336或403的任何氨基酸的位置，所述位置是参考SEQIDNO：1或SEQIDNO：3定义的。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述改变的特性是改变的贝壳杉烯酸13-羟化酶活性。4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述参考多肽包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：3的贝壳杉烯酸13-羟化酶。5.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中：(i)在位置136处存在甲硫氨酸或缬氨酸；(ii)在位置248处存在天冬酰胺；(iii)在位置336处存在丝氨酸；并且/或者(iv)在位置403处存在甘氨酸，所述位置是参考SEQIDNO:1或SEQIDNO:3定义的。6.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，所述多肽包含与SEQIDNO：1或SEQIDNO：3具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。7.具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽，所述多肽包含与SEQIDNO5、7、9、11或13中的任一个具有至少约95％序列同一性，至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。8.包含编码根据前述权利要求中任一项所述的多肽的序列的核酸。9.重组宿主，所述重组宿主包含根据权利要求8所述的核酸，任选地，所述重组宿主能够产生甜菊醇或甜菊醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰尼斯·古斯塔夫·恩斯特·范莱文，普利斯希勒·扎尔特简斯，维克托·马里厄斯·波尔，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL