用于纯化或分离微泡和外泌体的方法与组合物技术

本发明专利技术涉及外泌体的分离或提取。

Methods and compositions for purifying or separating microbubbles and exosomes

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化或分离微泡和外泌体的方法与组合物
本专利技术涉及细胞微泡、特别是外泌体，涉及分子建模并且涉及用于分离和隔离分子的色谱方法，包括离子交换色谱法。专利技术背景本说明书中对任何现有技术的引用不是并且也不应被视为承认或以任何形式暗示这种现有技术构成澳大利亚或任何其他管辖区域的公知常识的一部分。微泡是由膜结合的生物结构的异质集合。这些结构具有脂质双层，并且它们可存在于细胞内或细胞外环境中。微泡的大小在约20nm至1000nm的范围内。外泌体是小的脂质双层囊泡，由多种细胞类型分泌，并且直径在20至约150nm的范围内(如通过电子显微镜(EM)所测定)。与其他细胞来源的微泡不同，外泌体在细胞内空间内形成，并且然后由细胞分泌(Raposo和Stoorvogel，2013)。外泌体的脂质组成不同于起源细胞的脂质组成，但仍然是它们所起源的细胞类型的某种特征。此外，外泌体显示一些与其起源无关的常见脂质特征(Urbanelli等人，2013)。取决于它们的起源，外泌体可含有多种“货物”，包括但不限于肽、蛋白质、脂质、转录调控因子，信使RNA(mRNA)、非编码RNA(ncRNA)和双链DNA(dsDNA)。外泌体现在被认为是在诸如神经元突触、免疫调控、血管生成、组织再生和表观遗传调节的情况下，起源细胞(即外泌体所起源的细胞)可与靶细胞通讯的手段。这种通讯可以是本地化的或远程的。实际上，来自母乳的外泌体可调节新生儿的免疫和其他功能。这种通讯甚至可以是跨物种，例如但不限于调节人的免疫和其他功能的牛乳外泌体。外泌体可来源于各种生物流体，包括唾液、尿液、血液、血浆、(乳房)乳汁、滑液、腹水、汁液和果实提取物。综上所述，似乎外泌体的独特特征由它们的大小、通过内吞作用的细胞摄取、它们的“货物”驱动，并且它们递送在靶细胞中具有生物活性的“信息”。存在越来越多的证据表明外泌体可在各种疾病的发病和持续中起作用。从生物样品收集的外泌体可提供关于疾病当前状态的诊断信息。外泌体中RNA的浓度可比从体液(如血液)中直接提取的RNA的浓度高多达60倍，从而驱动它们在诊断学中的效用的潜力。例如，鉴定从人体液分离的外泌体内的致癌性RNA标志可潜在地在侵袭性癌症发展之前良好地产生异常状态的诊断。最近已经表明，治疗性间质型细胞的功能不依赖于细胞本身，而是由细胞产生的旁分泌因子(包括外泌体)，从而确定外泌体是循环细胞分泌因子的一部分，所述循环细胞分泌因子可介导在一些细胞疗法中以无细胞方式观察到的作用(Rani等人，2015)。从经历体外培养的细胞的条件培养基收集的治疗上有用的外泌体也可用作无细胞治疗剂，但是需要从其源液中分离的稳健、灵活的方法(Chen等人，2010)。此外，当基于细胞的表达系统专门定制时，外泌体可提供填充有治疗性蛋白质和RNA的天然递送载体。在常规光学显微镜下，外泌体是不可见的。用于检测这些超微观粒子如外泌体和微泡的技术包括电子显微镜(EM)、流式细胞术、动态光散射(DLS)和纳米粒子跟踪分析(NTA)。据报道，根据所使用的方法，报告的一升血液中细胞外囊泡的绝对数量可变化多达五个数量级(vanderPol等人，2010)。虽然外泌体是丰富的并且预期在诊断或治疗意义上有用，但是用于分离和纯化外泌体的方式限制了它们迄今为止的临床应用。通常，用于外泌体分离的现有方法特征在于以下两组：(i)由于囊泡的某些(可能是独特的)选择性外部特征(例如糖蛋白标记物、跨膜蛋白如四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82)和MHCI类和II类以及细胞溶质蛋白如热休克蛋白(HSP-70和HSP-90))所致的亲和力捕获(ii)基于外泌体的一些生物物理性质(例如大小、密度、ζ电位、含有脂质包装缺陷的高度弯曲的表面、膜曲率传感器)的分离或纯化这些技术的局限性列于下表中US2013/0273544(Vlassov)和US2015/0192571(Ghosh)两者均公开了包括聚乙二醇和某些多糖的聚合物作为体积排除聚合物以用于从溶液中沉淀微泡的用途。US20160216253公开了肝素用于分离细胞外囊泡的用途。需要一种用于分离外泌体的改进的方法，特别是提供提高的外泌体产率并且可扩展用于外泌体的药物级制造或生产并避免上述现有技术的其他限制的方法。
技术实现思路
本专利技术试图解决一种或多种上述需求或限制，并且在一个实施方案中提供了一种用于获得外泌体的分离物或组合物的方法。所述方法包括以下步骤：-提供包含外泌体的液体；-提供具有表面的基底，所述表面具有外泌体结合配体的阵列；-其中每种配体是呈阴离子或富电子基团的形式；并且-其中所述外泌体结合配体的阵列使外泌体能够结合至所述基底；-使所述液体与所述基底在使外泌体能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；-使所述基底与所述液体分离；从而获得外泌体的分离物或组合物。在另一个实施方案中，提供了一种用于获得外泌体的分离物或组合物的方法。所述方法包括以下步骤：-提供包含外泌体的液体；-提供具有表面的基底，所述表面具有外泌体结合配体的阵列；-其中每种配体在pH4-8、优选pH5至8下呈选自由以下组成的组的阴离子或富电子基团的形式：CO2H、CH2OH、CH2OSO3H、B(OH)2和CH2OP(O)(OH)2、或由它们的相关pKa决定的呈电离形式的那些基团；-其中每个配体与其他配体间隔约-其中所述外泌体结合配体的阵列使外泌体能够结合至所述基底；-使所述液体与所述基底在使外泌体能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；-使所述基底与所述液体分离；从而获得外泌体的分离物或组合物。在另一个实施方案中，提供了一种用于获得微泡的分离物或组合物的方法。所述方法包括以下步骤：-提供包含微泡的液体；-提供具有表面的基底，所述表面具有外泌体结合配体的阵列；-其中每种配体是呈阴离子或富电子基团的形式；并且-其中所述外泌体结合配体的阵列使微泡能够结合至所述基底；-使所述液体与所述基底在使微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；-使所述基底与所述液体分离；从而获得微泡的分离物或组合物。在另一个实施方案中，提供了一种用于获得微泡的分离物或组合物的方法。所述方法包括以下步骤：-提供包含微泡的液体；-提供具有表面的基底，所述表面具有外泌体结合配体的阵列；-其中每种配体在pH4-8、优选pH5至8下呈选自由以下组成的组的阴离子或富电子基团的形式：CO2H、CH2OH、CH2OSO3H、B(OH)2和CH2OP(O)(OH)2、或由它们的相关pKa决定的呈电离形式的那些基团。-其中每个配体与其他配体间隔约-其中所述外泌体结合配体的阵列使微泡能够结合至所述基底；-使所述液体与所述基底在使微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；-使所述基底与所述液体分离；从而获得微泡的分离物或组合物。本专利技术还提供了一种能够执行上述方法的设备或装置，所述设备或装置包括如上所述的基底。前述一般描述与下文的详细描述均仅仅是示例性和解释性的，并且意图对所要求保护的本专利技术提供进一步的解释。附图被包括来提供对本专利技术的进一步理解，并且被并入本说明书中并构成本说明书的一部分，说明了本专利技术的若干实施方案，并且与描述一起用于解释本专利技术的原理。附图说明图1-硫酸纤维素/cellufine的预测结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于获得外泌体或微泡的组合物或分离物的方法，所述方法包括：‑提供包含外泌体或微泡的液体；‑提供具有表面的基底，所述表面具有外泌体结合配体的阵列；‑其中每种配体是呈阴离子基团或富电子基团的形式；并且‑其中所述外泌体结合配体的阵列使外泌体或微泡能够结合至所述基底；‑使所述液体与所述基底在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；‑使所述基底与所述液体分离；从而获得外泌体或微泡的组合物或分离物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.23 AU 20169053691.一种用于获得外泌体或微泡的组合物或分离物的方法，所述方法包括：-提供包含外泌体或微泡的液体；-提供具有表面的基底，所述表面具有外泌体结合配体的阵列；-其中每种配体是呈阴离子基团或富电子基团的形式；并且-其中所述外泌体结合配体的阵列使外泌体或微泡能够结合至所述基底；-使所述液体与所述基底在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；-使所述基底与所述液体分离；从而获得外泌体或微泡的组合物或分离物。2.如权利要求1所述的方法，其中所述阵列由具有所述外泌体结合配体的一种或多种聚合物形成。3.如权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种聚合物包含具有至少一种外泌体结合配体的单体种类。4.如权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种聚合物的至少25％的单体包含外泌体结合配体。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种聚合物的所有单体具有外泌体结合配体。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阵列的每个配体...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·约瑟夫，J·帕尔默，I·狄克逊，G·利希夫斯，
申请(专利权)人：埃克波菲尔有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚,AU