一种3-磷酸甘油醛脱氢酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种3‑磷酸甘油醛脱氢酶及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明专利技术的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的3‑磷酸甘油醛脱氢酶具有促进微生物产甘油三酯(TAG)的功能，将含有本发明专利技术3‑磷酸甘油醛脱氢酶的重组高山被孢霉摇床培养7d，可使含有本发明专利技术3‑磷酸甘油醛脱氢酶的高山被孢霉中的总脂肪酸含量以及多不饱和脂肪酸含量分别较不含本发明专利技术3‑磷酸甘油醛脱氢酶的高山被孢霉提升12.56％以及12.79％，该结果为通过基因工程手段进一步提升高山被孢霉等产油微生物产甘油三酯(TAG)的能力，进而提高微生物产多不饱和脂肪酸(PUFAs)的能力提供了充实的理论支持。

A 3-phosphate glyceraldehyde dehydrogenase and its application

【技术实现步骤摘要】
一种3-磷酸甘油醛脱氢酶及其应用
本专利技术涉及一种3-磷酸甘油醛脱氢酶及其应用，属于酶工程和微生物工程

技术介绍
多不饱和脂肪酸(PUFAs)是指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸。由于其具有降低心脑血管疾病的功能且在维持身体健康和预防疾病等方面发挥着十分重要的作用，因此，多不饱和脂肪酸(PUFAs)作为一种保健品，在国内、国际均拥有巨大的市场。目前，市场上售卖的多不饱和脂肪酸(PUFAs)多来源于水生浮游植物，食此类植物为生的野鳕鱼、鲱鱼、鲑鱼等深海鱼类的内脏中也富含多不饱和脂肪酸(PUFAs)。但是，由于动植物的生长周期过于长且动植物的培育成本相对高，仅靠从这些动、植物中提取获得多不饱和脂肪酸(PUFAs)已无法满足日益增长的市场需求，因此，急需找到可以提升多不饱和脂肪酸(PUFAs)产量的方法。研究表明，有些细菌、真菌等微生物也具有生产脂质的功能，并且，这些细菌、真菌等微生物均具有生长周期短、繁殖快、培养成本低、不受地理环境及气候条件影响、环境友好等诸多优势，另外，这些细菌、真菌等微生物还具有油脂产量高、产得的油脂种类丰富等特点，因此，通过微生物产油脂提升多不饱和脂肪酸(PUFAs)的产量是一种极具潜力的方法。现有的关于微生物产油脂的研究多集中于对这些微生物的脂肪酸合成途径进行基因工程改造，尝试在微生物中表达脂肪酸合成途径中的某些酶，例如，底物供应途径中的关键酶以及还原力供应中的关键酶，以增加甘油三酯(TAG)产量。其中，部分还原力供应中的关键酶，例如，苹果酸酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶以及异柠檬酸脱氢酶等，也确实对微生物产油脂的能力产生了影响。因此，鉴于脂肪酸合成途径中部分还原力供应酶对微生物产油脂能力的巨大影响，挖掘更多可提供还原力的酶一定能够为提高微生物中甘油三酯(TAG)的产量，进而提高微生物中多不饱和脂肪酸(PUFAs)的产量提供更充实的理论依据。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种高山被孢霉(Mortierellaalpina，M.alpina)来源的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)以提高微生物产甘油三酯(TAG)的能力。[技术方案]为解决上述问题，本专利技术提供了一种3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH；EC1.2.1.12)，所述3-磷酸甘油醛脱氢酶为：(a)由SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有3-磷酸甘油醛脱氢酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本专利技术还提供了编码上述3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示。本专利技术还提供了携带上述基因的重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为DH5α载体、pYES2载体或pBIG2-ura5s-ITs载体。所述pBIG2-ura5s-ITs载体记载于公开号为CN103571762A的专利申请文本中。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pBIG2-ura5s-ITs载体。本专利技术还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌、根癌土壤杆菌或高山被孢霉。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为高山被孢霉。本专利技术还提供了上述3-磷酸甘油醛脱氢酶或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在生产甘油三酯方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述甘油三酯为多不饱和脂肪酸。本专利技术还提供了一种生产甘油三酯的方法，所述方法为将上述宿主细胞加入培养基中，于温度为25～28℃、转速为150～200rpm的条件下培养7～10d，得到甘油三酯。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基为Broth培养基。本专利技术还提供了上述3-磷酸甘油醛脱氢酶或上述基因或上述重组质粒在提高微生物酸胁迫能力方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物为大肠杆菌、根癌土壤杆菌或高山被孢霉。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物为高山被孢霉。本专利技术还提供了一种提高微生物抗酸胁迫能力的方法，所述方法为在微生物中过量表达3-磷酸甘油醛脱氢酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述3-磷酸甘油醛脱氢酶为：(a)由SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有3-磷酸甘油醛脱氢酶活性的由(a)衍生的蛋白质。在本专利技术的一种实施方式中，所述过量表达为先将编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因与表达载体连接以构建含有编码3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的重组质粒，再将重组质粒导入微生物中。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为DH5α载体、pYES2载体或pBIG2-ura5s-ITs载体。所述pBIG2-ura5s-ITs载体记载于公开号为CN103571762A的专利申请文本中。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pBIG2-ura5s-ITs载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物为大肠杆菌、根癌土壤杆菌或高山被孢霉。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物为高山被孢霉。本专利技术还提供了利用上述方法制备得到的抗酸胁迫能力提高的微生物。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物为大肠杆菌、根癌土壤杆菌或高山被孢霉。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物为高山被孢霉。[有益效果](1)本专利技术的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的3-磷酸甘油醛脱氢酶具有促进微生物产甘油三酯(TAG)的功能，将含有本专利技术3-磷酸甘油醛脱氢酶的重组高山被孢霉摇床培养7d，可使含有本专利技术3-磷酸甘油醛脱氢酶的高山被孢霉中的总脂肪酸含量以及多不饱和脂肪酸含量分别较不含本专利技术3-磷酸甘油醛脱氢酶的高山被孢霉提升12.56％以及12.79％；(2)本专利技术的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的3-磷酸甘油醛脱氢酶具有提高微生物抗酸胁迫能力的功能，将含有本专利技术3-磷酸甘油醛脱氢酶的重组高山被孢霉在pH为5的条件下摇床培养7d，可使含有本专利技术3-磷酸甘油醛脱氢酶的高山被孢霉中的总脂肪酸含量以及多不饱和脂肪酸含量分别较不含本专利技术3-磷酸甘油醛脱氢酶的高山被孢霉提升25.40％以及6.21％；将含有本专利技术3-磷酸甘油醛脱氢酶的重组高山被孢霉在pH为6的条件下摇床培养7d，可使含有本专利技术3-磷酸甘油醛脱氢酶的高山被孢霉中的总脂肪酸含量以及多不饱和脂肪酸含量分别较不含本专利技术3-磷酸甘油醛脱氢酶的高山被孢霉提升7.46％以及5.10％。附图说明图1：重组质粒pBIG2-ura5s-MaGAPDHA以及重组质粒pBIG2-ura5s-MaGAPDHB的构建示意图。图2：重组高山被孢霉M.alpina-pBIG2-ura5s-MaGAPDHA以及重组高山被孢霉M.alpina-pBIG2-ura5s-MaGAPDHB的琼脂糖凝胶电泳结果；其中，M表示marker，1表示阴性对照(野生型M.alpina)，2表示重组高山被孢霉M.alpina-pBIG2-ura5s-MaG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种3‑磷酸甘油醛脱氢酶，其特征在于，所述3‑磷酸甘油醛脱氢酶为：(a)由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有3‑磷酸甘油醛脱氢酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种3-磷酸甘油醛脱氢酶，其特征在于，所述3-磷酸甘油醛脱氢酶为：(a)由SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有3-磷酸甘油醛脱氢酶活性的由(a)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因。3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。4.携带权利要求2所述基因或权利要求3所述重组质粒的宿主细胞。5.权利要求1所述3-磷酸甘油醛脱氢酶或权利要求2所述基因或权利要求3所述重组质粒或权利要求4所述宿主细胞在生产甘油三酯方面的应用。6.一种生产甘油三酯的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求4所述宿主细胞加入培养基中，于温度为25～...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海琴，陈卫，王顺贤，唐鑫，赵建新，张灏，陈永泉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32