芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种芥蓝2‑含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1及其应用，所述Ba2ODD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术研究发现，通过RNAi沉默Ba2ODD1基因对芥蓝硫苷组分与含量的影响，验证Ba2ODD1基因在有害硫苷PRO合成中的功能。结果显示，Ba2ODD1基因RNAi转基因植株中PRO硫苷的含量降低，表明沉默Ba2ODD1基因的表达，可降低转基因材料中有害硫苷含量，创制得到有害硫苷含量低的芥蓝新材料，该材料可进一步用于培育有害硫苷含量低的芥蓝新品种。

Ba2ODD1 gene of 2-oxygen-dependent dioxygenase in Chinese kale and its application

【技术实现步骤摘要】
芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1及其应用
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1及其应用。
技术介绍
硫代葡萄糖苷(glucosinolates，简称硫苷)是广泛存在于白花目植物中的含硫次级代谢产物，到目前已发现120多种(Faheyetal.,2001)，其降解产物具有活跃的生化特性，能在食品中赋予产品特殊风味，对植物本身起到抗病虫作用。同时它还是化学保护剂，能防止多种癌症的发生(HalkierandGershenzon,2006)。但除了对人类有益的硫苷外，几乎所有重要芸薹属蔬菜中都存在数量不等的2-羟基-3-丁烯基硫苷(PRO)，该硫苷是芸薹属蔬菜苦味的主要来源(Petersonetal.,2000)，其降解产物5-乙烯唑烷-2-硫酮能引起猪和家禽甲状腺肿(Hansenetal.,2008)。因此高含量的PRO严重影响芸薹属蔬菜的营养品质和潜在的商品价值(Liuetal.,2012)。PRO位于硫苷合成途径C4支链的最末端。一个位于GSK-OH位点的2-含氧依赖性双加氧酶基因(ODD)编码的酶催化3-丁烯基硫苷(NAP)羟基化形成PRO(图1)。目前芸薹属植物中还未见该基因在PRO合成中的功能分析。芥蓝属芸薹属，是我国华南地区特色蔬菜之一，主要以花薹为产品，有着悠久栽培历史和丰富种质资源(张海峰,2006)。芥蓝具有很高的营养价值，含有丰富的维生素、矿物质和硫代葡萄糖苷等(何洪巨等,2002；张慎好等,2004；张海峰,2006)。大量研究表明芥蓝是抗癌硫苷4-甲基亚磺酰丁基硫苷(RAA)含量最丰富的蔬菜之一，某些芥蓝品种的RAA含量甚至超过具有良好保健和营养价值的青花菜。目前已经在芥蓝各基因型中鉴定到的硫苷约有14种(司雨等,2009；)，其中主要为3-丁烯基硫苷(NAP)，约占总硫苷的40％～60％。NAP与PRO同位于脂肪族硫苷合成途径C4支链(图1)，然而不同的基因型中NAP向PRO转化效率(PRO/NAP值)差异极大，专利技术人前期通过测定42个芥蓝基因型花薹中的硫苷组分，发现不同基因型PRO/NAP差异显著，最多达到50倍，说明在芥蓝不同基因型中可能存在不同的ODD表达模式；由于PRO含量过高会严重影响芸薹属蔬菜的营养品质和潜在的商品价值且PRO的降解产物会影响牲畜健康，因此如何找寻一种可有效降低芸薹属蔬菜中有害硫苷含量的方法已成为目前迫切需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中还未见有可降低芸薹属蔬菜有害硫苷含量的方法的缺陷和不足，提供一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1，并通过构建该基因的沉默表达载体，遗传转化至芸薹属蔬菜中，获得了有害硫苷含量低的芸薹属蔬菜新品种。本专利技术的第一个目的是提供一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1。本专利技术的第二个目的是提供一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶Ba2ODD1。本专利技术的第三个目的是提供所述芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1在制备有害硫苷含量低的芸薹属蔬菜新品种中的应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术在前期对42个芥蓝基因型硫苷组分及含量分析的基础上，以芥蓝基因型矮脚香菇为材料，克隆得到了芥蓝Ba2ODD1基因，大小为1070bp，编码358个氨基酸。一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶Ba2ODD1，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。一种含芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1的表达载体。优选地，所述表达载体为Ba2ODD1基因RNAi干涉载体。一种含上述表达载体的重组体。本专利技术以芥蓝基因型矮脚香菇为材料，通过RNAi沉默Ba2ODD1基因在芥蓝中的表达量，查看Ba2ODD1基因表达对芥蓝硫苷组分与含量的影响，验证Ba2ODD1基因在有害硫苷PRO合成中的功能。结果显示，Ba2ODD1基因RNAi转基因植株中PRO硫苷的含量降低，表明沉默Ba2ODD1基因的表达，可降低转基因材料中有害硫苷含量，创制得到有害硫苷含量低的芥蓝新材料，该材料可进一步用于培育有害硫苷含量低的芥蓝新品种。由于芥蓝为芸薹属蔬菜，且芸薹属蔬菜中普遍存在数量不等的有害硫苷，因此，所述Ba2ODD1基因在制备有害硫苷含量低的芸薹属蔬菜新品种中的应用也在本专利技术保护范围内。优选地，所述有害硫苷为2-羟基-3-丁烯基硫苷。优选地，所述应用为降低、敲除或沉默Ba2ODD1基因在芸薹属蔬菜中的表达，从而得到有害硫苷含量低的芸薹属蔬菜新品种。优选地，所述应用为构建Ba2ODD1基因的沉默表达载体，再遗传转化至芸薹属蔬菜中，获得有害硫苷含量低的芸薹属蔬菜新品种。优选地，所述芸薹属蔬菜为芥蓝。优选地，所述芥蓝为矮脚香菇芥蓝。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1，所述基因大小为1070bp，编码358个氨基酸。通过RNAi沉默Ba2ODD1基因在芥蓝中的表达量，发现Ba2ODD1基因RNAi转基因植株中PRO硫苷的含量降低，表明沉默Ba2ODD1基因的表达，可降低转基因材料中有害硫苷含量，创制得到有害硫苷含量低的芥蓝新材料，该材料可进一步用于培育有害硫苷含量低的芥蓝新品种。附图说明图1为芸薹属植物中脂肪族硫苷合成途径C4支链简图；(参考Lietal.,2001；Liuetal.,2012)。图2为Ba2ODD1基因PCR扩增片段电泳检测图；M：DL2,000DNAMarker；1：Ba2ODD1基因条带。图3为Ba2ODD1基因重组RNAi载体构建示意图。图4为Ba2ODD1基因RNAi载体转化植株PCR鉴定和基因表达分析；A：为干涉载体插入正义片段PCR检测阳性克隆；B：干涉载体插入反义片段检测阳性克隆；C：抗性植株PCR鉴定图；D：植株形态图；E：转化植株Ba2ODD1基因qPCR分析图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。矮脚香菇芥蓝由华南农业大学芥蓝课题组提供；大肠杆菌：DH5a，农杆菌：EHA105，本实验室保存；pFGC5941载体由本实验室保存。PCRmix由Tag酶和dNTP等混合而成，购自Genestar公司，pMD19-T购自TakaRa公司，引物合成交由生工生物技术有限公司合成。2％CTAB抽提液：1gCTAB，5ml1MTris，2ml500mMEDTA，4.1gNaCl至50ml；X-gal:20mg/ml，用二甲基甲酰胺溶解；IPTG：200mg/ml，200mgIPTG溶解于0.8ml水中，定容至1ml，并经过无菌的0.22μm的滤膜过滤除菌；凝胶电泳所需的0.5×TBE：Tris54g,硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml，定容至1L。实施例1芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1的克隆一、方法1、芥蓝DNA和RNA的提取采用改良的CTAB法(Murry&a本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种芥蓝2‑含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶Ba2ODD1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种含权利要求1所述基因的表达载体。4.一种含权利要求3所述表达载体的重组体。5.权利要求1所述Ba2ODD1基因在制备有害硫苷含量低的芸薹属蔬菜新品种中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述有害硫苷为2-羟基-3-丁烯...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈长明，雷建军，陈国菊，曹必好，吴双花，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44