哺乳动物细胞冷冻保存液制造技术

本发明专利技术的课题在于，提供能够将哺乳动物细胞冷冻保存、并在融化后有效地抑制细胞死亡的细胞冷冻保存液及哺乳动物细胞施予用液、使用了所述细胞冷冻保存液的哺乳动物细胞的冷冻保存方法。将含有2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或者它们的盐、4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或者它们的盐、和DMSO或甘油的等渗液作为哺乳动物细胞冷冻保存液或哺乳动物细胞施予用液，将哺乳动物细胞冷冻保存于所述细胞冷冻保存液中时，较之以往的哺乳动物细胞冷冻保存液而言，能够有效地抑制融化后的细胞死亡。

Cryopreservation solution for mammalian cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】哺乳动物细胞冷冻保存液
本专利技术涉及：包含含有2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或者它们的盐(以下有时也称为“海藻糖类”)、4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或者它们的盐(以下有时也称为“葡聚糖类”)、和二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide；以下称为“DMSO”)或甘油(glycerol)的等渗液的哺乳动物细胞冷冻保存液及哺乳动物细胞施予用液；包括将哺乳动物细胞冷冻保存于上述哺乳动物细胞冷冻保存液中的步骤的哺乳动物细胞的冷冻保存方法。
技术介绍
细胞的冷冻保存作为细胞生物学的研究中必不可少的技术正被广泛利用。近年来，细胞冷冻保存技术不限于仅全世界的细胞库中各种株化细胞的保存，也应用于以畜牧业界的品种保存、家畜增产为目的的精子、卵子、或受精卵的冷冻保存、生殖医疗中的生殖细胞的冷冻保存等。胚胎干细胞(EmbryonicStemcell，ES细胞)、诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell，iPS细胞)等多能干细胞是具有无限的增殖能力和分化为多种组织细胞的多分化能力的细胞。人多能干细胞被期待利用其性质而应用于再生医疗，为了实现这一点，必须确立优质的细胞冷冻技术、即在解冻后保障高细胞存活率、未分化性的细胞冷冻技术。细胞的冷冻保存方法一般可大致分为缓慢冷冻法和急速冷冻法(玻璃化法)。缓慢冷冻法是将细胞悬浮于含有甘油、DMSO、角蛋白水解物、水解明胶、血清、血清白蛋白等作为冷冻保护剂的冷冻保存液(专利文献1～5)中，使温度每1分钟下降1℃左右从而缓缓冷冻的方法。通过缓慢地冷却，细胞内的水分子与冷冻保护剂置换而进行脱水，细胞内、细胞周边部的冰晶的成长被抑制，防止细胞膜及细胞内结构的损伤、蛋白质的变性及断裂(非专利文献1)。最近，已明确除了冷冻保存胚胎的情况以外，在冷冻保存通常的细胞的情况下，即使不使用程序冷冻仪严密地控制温度调节，使用泡沫苯乙烯箱、市售的细胞冷冻箱也能够缓慢地进行冷冻。上述方法由于简便，因此也被称为简易缓慢冷冻法，正广泛用于实验室、细胞库等。另一方面，玻璃化法是为了抑制由冷冻导致生成细胞内外的冰晶而通过急速冷却而冷冻成玻璃状的方法。玻璃化法的技术开发自1937年被报道至实用化为止耗费了较长时间，在1985年开发了使用含有冷冻保护剂(其包含高浓度的DMSO、乙酰胺、丙二醇、及聚乙二醇)的玻璃化保存液的方法。通过开发该方法，小鼠早期胚胎的冷冻保存、就缓慢冷冻法而言是困难的牛胚胎、猪胚胎的冷冻保存成为可能。目前，以胚胎库为代表的多数机构中正使用玻璃化法。最近，积极地进行了人ES细胞、iPS细胞的冷冻保存液的开发、冷冻保存方法的改良。例如，公开了将人ES细胞悬浮于含有5％的DMSO、10％胎牛血清(Fetalbovineserum；FBS)、及10％乙二醇(EG)的冷冻保存液中，使用简易缓慢冷冻法进行冷冻保存时，融化后的细胞存活率升高(非专利文献2)。另外，公开了将人ES细胞、iPS细胞悬浮于冷冻保存液(STEM-CELLBANKER[日本全药工业公司制])中，使用简易缓慢冷冻法进行冷冻保存时，融化后的细胞存活率升高(非专利文献3)。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2003/064634号小册子专利文献2：日本特开平6-46840号公报专利文献3：日本特开平7-255469号公报专利文献4：日本特开平8-325101号公报专利文献5：日本特开2002-233356号公报非专利文献非专利文献1：J.R.Dobrinsky,Theriogenology,45,17-26(1996)非专利文献2：Y.S.Ha等，HumanReprod.,20,1779-1785(2005)非专利文献3：F.Holm等，HumanReprod.,25,1271-1279(2010)
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的课题在于，提供能够将哺乳动物细胞冷冻保存、并在融化后有效地抑制细胞死亡的细胞冷冻保存液及哺乳动物细胞施予用液、使用了该细胞冷冻保存液的哺乳动物细胞的冷冻保存方法。用于解决课题的手段本申请的专利技术人在为了解决上述课题而反复深入研究的过程中，发现将哺乳动物细胞冷冻保存于向等渗液中添加DMSO或甘油、进而添加海藻糖类及葡聚糖类以使其分别为2.0～6.0(w/v)％及4.0～7.0(w/v)％而成的溶液中时，较之以往的哺乳动物细胞冷冻保存液而言，能够有效地抑制融化后的细胞死亡，从而完成了本专利技术。即，本专利技术如下所述。〔1〕哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，其包含等渗液，所述等渗液含有：2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或者它们的盐；4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或者它们的盐；和DMSO或甘油。〔2〕如上述〔1〕所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞。〔3〕如上述〔2〕所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞。〔4〕如上述〔1〕～〔3〕中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，DMSO或甘油为1.0～15(v/v)％的DMSO。〔5〕如上述〔1〕～〔4〕中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，等渗液为乳酸林格液。〔6〕哺乳动物细胞施予用液，其特征在于，其包含上述〔1〕～〔5〕中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液。〔7〕如上述〔6〕所述的哺乳动物细胞施予用液，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞。〔8〕如上述〔7〕所述的哺乳动物细胞施予用液，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞。〔9〕哺乳动物细胞的冷冻保存方法，其特征在于，所述冷冻保存方法包括将哺乳动物细胞冷冻保存于上述〔1〕～〔5〕中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液中的步骤。〔10〕如上述〔9〕所述的冷冻保存方法，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞。〔11〕如上述〔10〕所述的冷冻保存方法，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞。作为本专利技术的其他实施方式，可举出：用于冷冻保存哺乳动物细胞的、海藻糖类与葡聚糖类与DMSO或甘油与等渗液的组合；海藻糖类与葡聚糖类与DMSO或甘油与等渗液的组合的用于制备哺乳动物细胞冷冻保存液的用途。专利技术效果根据本专利技术，较之以往的哺乳动物细胞冷冻保存液而言，能够有效地抑制将经冷冻保存的哺乳动物细胞融化时的细胞死亡，因此，能够提供再生医疗中的优质的含移植用细胞的溶液。具体实施方式本专利技术的哺乳动物细胞冷冻保存液是限于“用于冷冻保存哺乳动物细胞”的用途的、包含等渗液(以下有时也称为“本申请的冷冻保存液”)的液体，所述等渗液含有：海藻糖类；葡聚糖类；和，DMSO及/或甘油。作为上述等渗液，只要是利用钠离子、钾离子、钙离子等对盐浓度、糖浓度等进行调节以使得与体液、细胞液的渗透压几乎相同的等渗液即可，没有特别限定，具体而言，可举出生理盐水、具有缓冲效果的生理盐水(磷酸缓冲生理盐水[Phosphatebufferedsaline；PBS]、Tris缓冲生理盐水[TrisBufferedSaline；TBS]、HEPES缓冲生理盐水等)、林格液、乳酸林格液、乙酸林格液、碳酸氢盐林格液、5％葡萄糖水溶液、动物细胞培养用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，其包含等渗液，所述等渗液含有：2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或者它们的盐；4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或者它们的盐；和二甲基亚砜或甘油。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.14 JP 2016-2422001.哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，其包含等渗液，所述等渗液含有：2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或者它们的盐；4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或者它们的盐；和二甲基亚砜或甘油。2.如权利要求1所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞。3.如权利要求2所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞。4.如权利要求1～3中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，二甲基亚砜或甘油为1.0～15(v/v)％的二甲基亚砜。5.如权利要求1～4中任一项所述的哺乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：西村益浩，渡边奈月，藤田泰毅，和田圭树，
申请(专利权)人：株式会社大塚制药工场，
类型：发明
国别省市：日本,JP