一种高成骨分化能力人间充质干细胞及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高成骨分化能力人间充质干细胞及其制备方法，其制备方法包括如下步骤：1）组织块法分离、培养原代人间充质干细胞；2）原代人间充质干细胞的传代培养；3）传代人间充质干细胞的质量控制与安全性评价体系检测；4）高成骨分化能力人间充质干细胞的诱导培养：添加有小分子药物SB431542的成骨诱导培养基中诱导培养高成骨分化能力人间充质干细胞。本发明专利技术通过小分子药物SB431542对人间充质干细胞进行成骨诱导分化，使其具有定向成骨分化能力，操作简单、生产成本低，制得的人间充质干细胞具有较高成骨分化能力，可起到细胞替代的作用，克服细胞移植来源少的问题，小分子药物SB431542安全可靠，可应用于颌骨组织缺损的骨修复，具有重要的医学价值。

A Human Mesenchymal Stem Cell with High Osteogenic Differentiation Ability and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
一种高成骨分化能力人间充质干细胞及其制备方法
本专利技术涉及间充质干细胞
，尤其涉及一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法。
技术介绍
外伤、炎症、肿瘤切除以及先天性疾病造成的颌骨组织缺损是临床上常见的问题，目前主要通过骨修复方法进行治疗，包括自体骨、异体骨及异种骨移植，其中以自体骨移植为“金标准”。但目前常规的骨皮瓣修复、自体髂骨移植以及骨替代材料的修复方案都具有一定的缺陷，比如要增加额外的手术位点、自体骨骨量有限、异体骨免疫排斥反应以及修复材料在骨缺损中心处的低血管化，都不能较好地满足临床上的修复要求，且可能伴有各种并发症。研究表明，骨缺损的自行修复结果通常取决于缺损的范围以及缺损处的血供等情况，当缺损较大时，骨组织将不足以完全修复缺损，因此，对于大范围的颌骨组织缺损，骨修复往往无法达到预期疗效，需采用以纤维组织为主的修复方式。因此急需寻找新的治疗方法以达到更好的骨再生效果，解除常规骨修复失败给患者带来的痛苦。间充质干细胞是一类具有自我复制、不断更新和多向分化能力的细胞，在特定条件下可分化为骨、软骨、肌肉或肌腱，为临床治疗各种创伤提供细胞来源，用间充质干细胞分化为真皮组织，可覆盖于烧伤创面。其中人间充质干细胞因具有较高的成骨潜能，且能够分化成各种其他的细胞类型，已成为颌面缺损再生修复技术中最常用的细胞，已有大量的医疗机构通过自体骨髓干细胞移植治疗大范围骨缺损的临床病例。研究表明，自体骨髓间充质干细胞复合骨粉植骨效果优于常规植骨，因此，目前间充质干细胞的来源主要为自体髂骨骨髓间充质干细胞，但自体髂骨骨髓间充质干细胞在体内主要通过旁分泌作用发挥生物学效应，而通过定向分化特定的细胞的效率低下，难以起到细胞替代的作用，导致目前以间充质干细胞为基础的组织工程技术应用于骨缺损的效果难以达到满意效果。前期试验表明，小分子药物SB431542作为一种特异的TGF-β信号通路抑制剂，能够通过抑制ALK4/ALK5/ALK7而抑制TGF-β信号通路的表达，具有促进人间充质干细胞成骨的能力。因此，利用小分子药物SB431542对人间充质干细胞进行成骨诱导分化，使其具有定向的成骨分化能力，将解决了上述临床案例中细胞定向分化效率低下的问题，具有重要医学价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，本专利技术通过小分子药物SB431542对人间充质干细胞进行成骨诱导分化，使其具有定向的成骨分化能力，进而起到细胞替代的作用，克服细胞移植来源少的问题，该方法操作简单、生产成本低，安全可靠，生产出的间充质干细胞具有较强的成骨分化能力，具有重要的医学价值。为实现上述技术目的，本专利技术采取的技术方案为：一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：1.1）组织块法分离、培养原代人间充质干细胞；1.2）原代人间充质干细胞的传代培养；1.3）传代人间充质干细胞的质量控制与安全性评价体系检测；1.4）高成骨分化能力人间充质干细胞的诱导培养：将融合度为70-80％的人间充质干细胞置于添加有小分子药物SB431542的成骨诱导培养基中培养至形成具有较强成骨分化能力的人间充质干细胞膜片。进一步地，步骤1）中的人间充质干细胞为人牙龈间充质干细胞，组织块法分离、培养人牙龈间充质干细胞包括如下步骤：1.1）人牙龈间充质干细胞的获取：收集提取人牙龈组织，存储在无菌的50ml离心管中；1.2）人牙龈间充质干细胞的分离与原代培养，具体包括以下步骤：1.2.1）通过4℃医用保温箱将存储于50ml离心管中的牙龈组织转移至GMP级临床干细胞制备室，在生物安全柜中无菌取出牙龈组织；1.2.2）将牙龈组织用含2%青链霉素的DPBS缓冲液(+Ca2+，+Mg2+)洗涤3次，5min/次；1.2.3）使用显微剪将洗涤后的牙龈组织剪切为0.5cm×0.5cm的组织块，然后将组织块均匀接种于间充质干细胞完全培养基（DMEM+15%胎牛血清+1%青链霉素）中，并置于温度为37℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养，以获得人牙龈间充质干细胞，并记为P0代，P0代人牙龈间充质干细胞培养72h后，更换培养液，弃去未贴壁细胞，根据细胞生长情况，之后每2天或3天更换一次新鲜培养液，倒置显微镜下观察细胞融合度。进一步地，步骤2）中人间充质干细胞的传代培养为：待步骤1.2.3）中的P0代人牙龈间充质干细胞长至融合度为80%-90%时，加入Tryple消化，用倒置相差显微镜观察细胞消化情况，终止消化后，按1:1～1:4的比例传代，记为P1、P2、P3等数代细胞。进一步地，步骤3）中传代人间充质干细胞的质量控制与安全性评价体系检测包括以下五方面检测：3.1）人牙龈间充质干细胞形态的形态学观察：利用倒置显微镜观察P2或P3代人牙龈间充质干细胞的形态，筛选出细胞形态均一、均呈现成纤维形态，符合间充质干细胞形态特点的人牙龈间充质干细胞；3.2）人牙龈间充质干细胞表面标志物的鉴定：利用流式细胞仪检测鉴定步骤3.1）中的人牙龈间充质干细胞表面标志物，筛选出与间充质干细胞表面标志物通用标准一致的人牙龈间充质干细胞；3.3）人牙龈间充质干细胞的多能性分化检测：利用商业化人牙龈间充质干细胞成骨诱导试剂盒、人牙龈间充质干细胞成脂诱导试剂盒和人牙龈间充质干细胞成软骨诱导试剂盒对步骤3.1）中的人牙龈间充质干细胞分别进行成骨、成脂和成软骨分化能力鉴定，筛选出具有成骨、成脂和成软骨分化能力的人牙龈间充质干细胞；3.4）微生物检测：对步骤3.1）中的人牙龈间充质干细胞的上清进行细菌、真菌、支原体和病毒检测，其中支原体采用支原体IST试剂盒检测、病毒通过PCR检测、细菌和真菌通过营养液培养检测，筛选出无细菌、真菌、支原体和病毒感染的人牙龈间充质干细胞；3.5）致瘤性检测：取一定量步骤3.1）中的人牙龈间充质干细胞注射到雄性SPF级裸鼠颈部皮肤，饲养12周，观察小鼠状态及有无肿瘤形成，确定细胞的可适用性，保证临床输注安全，筛选出无致瘤性的人牙龈间充质干细胞。进一步地，步骤4）的人间充质干细胞为经步骤3）的质量控制与安全性评价体系检测符合间充质干细胞形态特点、表面标志物与间充质干细胞表面标志物通用标准一致、具有成骨、成脂和成软骨分化能力及无微生物和致瘤性的处于对数生长期的人牙龈间充质干细胞。进一步地，步骤4）的高成骨分化能力人间充质干细胞的诱导培养为：倒置显微镜下观察权利要求5所述的人牙龈间充质干细胞的融合度，在细胞生长至融合度为70-80%时，弃培养基洗涤，Tryple消化制成细胞悬液，以5×103个细胞/每孔的密度接种于12孔板，添加含有小分子药物SB431542的成骨诱导培养基，诱导培养基每3天更换一次，连续培养14天形成具有较强成骨分化能力的人牙龈间充质干细胞膜片，在培养21天后，利用茜素红染色，显微镜下观察并拍照，以鉴定诱导的高成骨分化能力人牙龈间充质干细胞的成骨分化能力。进一步地，所述成骨诱导培养基为含有15%胎牛血清、1.8mM磷酸二氢钾、0.1mM维生素C、10^-8M地塞米松的α-MEM培养基。进一步地，所述小分子药物SB431542的浓度为1μM。一种高成骨分化能力人间充质干细胞，由上述一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法制备产生。本专利技术具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1.1）组织块法分离、培养原代人间充质干细胞；1.2）原代人间充质干细胞的传代培养；1.3）传代人间充质干细胞的质量控制与安全性评价体系检测；1.4）高成骨分化能力人间充质干细胞的诱导培养：将融合度为70‑80％的人间充质干细胞置于添加有小分子药物SB431542的成骨诱导培养基中培养至形成具有较强成骨分化能力的人间充质干细胞膜片。

【技术特征摘要】
1.一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1.1）组织块法分离、培养原代人间充质干细胞；1.2）原代人间充质干细胞的传代培养；1.3）传代人间充质干细胞的质量控制与安全性评价体系检测；1.4）高成骨分化能力人间充质干细胞的诱导培养：将融合度为70-80％的人间充质干细胞置于添加有小分子药物SB431542的成骨诱导培养基中培养至形成具有较强成骨分化能力的人间充质干细胞膜片。2.根据权利要求1所述的一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤1）中的人间充质干细胞为人牙龈间充质干细胞，组织块法分离、培养人牙龈间充质干细胞包括如下步骤：1.1）人牙龈间充质干细胞的获取：收集提取人牙龈组织，存储在无菌的50ml离心管中；1.2）人牙龈间充质干细胞的分离与原代培养，具体包括以下步骤：1.2.1）通过4℃医用保温箱将存储于50ml离心管中的牙龈组织转移至GMP级临床干细胞制备室，在生物安全柜中无菌取出牙龈组织；1.2.2）将牙龈组织用含2%青链霉素的DPBS缓冲液(+Ca2+，+Mg2+)洗涤3次，5min/次；1.2.3）使用显微剪将洗涤后的牙龈组织剪切为0.5cm×0.5cm的组织块，然后将组织块均匀接种于间充质干细胞完全培养基（DMEM+15%胎牛血清+1%青链霉素）中，并置于温度为37℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养，以获得人牙龈间充质干细胞，并记为P0代，P0代人牙龈间充质干细胞培养72h后，更换培养液，弃去未贴壁细胞，根据细胞生长情况，之后每2天或3天更换一次新鲜培养液，倒置显微镜下观察细胞融合度。3.根据权利要求1所述的一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤2）中人间充质干细胞的传代培养为：待步骤1.2.3）中的P0代人牙龈间充质干细胞长至融合度为80%-90%时，加入Tryple消化，用倒置相差显微镜观察细胞消化情况，终止消化后，按1:1～1:4的比例传代，记为P1、P2、P3等数代细胞。4.根据权利要求1所述的一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤3）中传代人间充质干细胞的质量控制与安全性评价体系检测包括以下五方面检测：3.1）人牙龈间充质干细胞形态的形态学观察：利用倒置显微镜观察P2或P3代人牙龈间充质干细胞的形态，筛选出细胞形态均一、均呈现成纤维形态，符合间充质干细胞形态特点的人牙龈间充质干细胞；3.2）人牙龈间充质干细胞表面标志物的鉴定：利用流式细胞仪检测鉴定步骤3.1）中的人牙龈间充质干细胞表面标志物，筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32