一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法技术

本发明专利技术公开一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法，其包括如下步骤：先对脐带进行细胞胞体培养，之后将分离得到的间充质干细胞进行鉴定、复苏扩增细胞、收集清洗细胞体用于细胞胞内活性肽的提取、液氮反复冻融法破碎细胞收集细胞胞内活性肽、采用真空冷冻干燥机对细胞胞内活性肽液进行冻干浓缩得到活性肽冻干粉。本发明专利技术细胞多肽库具有更大的多样性、新的天然生物活性肽库的来源、在人类疾病治疗和抗衰护肤领域添加具有更好的相容性。

A Construction Method of Intracellular Functional Physiological Active Peptide Library Derived from Cell Soma

【技术实现步骤摘要】
一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法
本专利技术涉及生物学
，尤其涉及一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法。
技术介绍
肽是一类分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，是生命体内发挥各种生理功能不可或缺的物质，其中对人体生命活动有益的生理作用的肽类又称功能肽（functionalbiopeptide）。从物质组成结构，肽由氨基酸组成，由不同的氨基酸的种类排序加上一些可能的二级甚至三级结构，具有显著的生理活性。在肽的提取上，目前已经从动，植物和微生物中分离出多种多样的生物活性肽。现有研究表明，生物活性肽在调节生物体内酶，抑菌，调节机体免疫功能，抗血栓，抗氧化清除机体自由基，改善机体的物质吸收和运输机能等各方面都发挥重要的生理作用。近几年，因生物活性肽在抗衰领域的研究越来越充分，生物活性肽在护肤应用于护肤品市场也受到青睐。德国鲍威尔﹒克鲁德博士说：“找到了一个新的抗衰老药物——肽。肽能使人变的年轻、健康，肽使化妆品世界发生了巨大变化。”美国皮肤老化国际研究会主席尼古拉斯﹒佩里扎医学博士“肽、神经肽——这类强大的化学物具有活化皮肤和头发，促进心脏健康，降低许多疾病的发病几率并强化免疫系统等诸多功效。”尼古拉斯﹒佩里扎医学博士已在美国出版了《佩里扎的承诺》《肽、神经肽，28天让我们年轻10岁》。生活活性肽是筛选药物，美容抗衰有效成分的天然资源宝库。目前生物活性肽的来源主要有两种方式：第一种通过各种方式人工合成，比如化学合成法，酶法或者目前广泛使用的重组DNA技术合成。人工合成目前普通应用，但是各种方法都具有局限性。化学合成法适合一些短片段的肽的合成，成本高，在合成反应过程中对环境和人体健康都有一些影响。重组DNA技术只限一些大肽和蛋白质的生产。第二种方式是提取生物体内的天然的各种活性肽。通过国内外对肽的基础研究可以看出，基因工程和蛋白工程的研究大大推动了我国活性肽的生产和应用，从天然成分中分离各种生物活性肽一直是我们生物活性肽研究的主流。以往工艺中主要从各种益生菌或者酵母菌中分离各种生物活性肽，比如啤酒酵母，瑞士乳杆菌主要是通过蛋白质水解在分离精化而来，基本工艺流程，以木瓜蛋白酶制备多肽液工艺路线流程为例：啤酒酵母——预处理——啤酒酵母与水搅拌均匀——添加蛋白酶酶解——酶灭活——离心——收集上清。从各种益生菌和酵母菌中分离生物活性多肽已经广泛应用于各个方面，尤其是使用在食品或者食品添加上，但是依旧存在局限，（1）啤酒酵母含有大颗粒酒花，树脂等杂质，需要预先处理，在处理过程中对环境和人健康存在一些不利的影响。（2）此方法分离的肽主要使用在食品或者食品添加上，多肽能提供氨基酸等人体的物质元素，来源于益生菌和酵母分离的多肽与人体种属差异性太大，因为生命体中的生理作用机制相差很大，所以，很难发挥其多肽的生理功能。因此目前广泛使用的多肽来源一般作为食品感官肽应用，提供基础营养物质和改善食品感官性状，比如增强风味肽，味觉肽，硬度调节肽等。还是无法完全满足人体疾病和美容抗衰领域中生理功能肽的需求。因此需要开发更多的天然生物活性肽来源，使得分离得到的活性肽更加纯化，且不仅仅是用在食品或者食品添加剂上，能够满足人体疾病和美容抗衰领域的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种细胞多肽库具有更大的多样性、新的天然生物活性肽库的来源、在人类疾病治疗和抗衰护肤领域添加具有更好的相容性的细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法。本专利技术解决其技术问题，采用的技术方案是，提出一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法，其包括如下步骤：a、细胞胞体培养：将脐带剪成小段并放入含2%双抗的PBS洗液中洗涤2～3次，之后放入培养皿中并剪碎至糊状，加入培养基并搅拌均匀，之后移入培养瓶中并加入培养基，将培养瓶放入CO2培养箱，5～9天后往培养瓶中加入培养基，之后在显微镜下观察到培养瓶局部出现细胞融合度达到90%以上时，用胰酶消化传代并收集；b、将分离得到的间充质干细胞进行鉴定：对胰酶消化后的细胞使用细胞染色缓冲液或PBS洗涤液进行洗涤，之后1000～2000rpm离心细胞悬液5～10min，弃掉上清液后加染色缓冲液制成细胞悬液,将细胞悬液加入流式管中备用，之后对细胞悬液进行封闭Fc受体，并对细胞悬液中加入荧光标记的抗体，混匀后置于冰上，避光孵育30～40min，加入FACs缓冲液或PBS洗涤液重悬细胞，1000～2000rpm离心细胞悬液5～10min，弃掉上清液后加入FACs缓冲液或PBS洗涤液重悬细胞，之后用流式细胞仪碱性检测和分析；c、复苏扩增细胞：将细胞冻存后取出放入37℃水浴锅中，使其全部融化，在放有培养基的离心管内放入解冻的细胞悬液，之后1000～2000rpm离心5～10min并倒去上清液，向离心管中加入培养基吹打均匀，离心洗涤并倒去上清液，加入培养基重悬细胞，转移至培养瓶后放入CO2培养箱培养24～48h，之后吸出培养基加入PBS洗涤液进行洗涤，洗涤完成后吸出洗涤液并加入胰酶，直至肉眼可见贴壁细胞层有大量细胞掉落后加入培养基终止消化，吹打细胞层并吸取细胞悬液于离心管内1000～2000rpm离心5～10min，倒去上清液，再加入培养基重悬、离心洗涤，倒去上清液，加入培养基重悬，转移至培养瓶后放入CO2培养箱培养；d、收集清洗细胞体用于细胞胞内活性肽的提取：观察到培养瓶内的细胞融合度达到85～90%后吸出培养基，加入PBS洗涤液洗涤，洗涤完成后吸出洗涤液并加入胰酶，直至肉眼可见贴壁细胞层有大量细胞掉落后加入培养基终止消化，吹打细胞层并吸取细胞悬液于离心管内1000～2000rpm离心5～10min，倒去上清液，再加入PBS洗涤液重悬、离心洗涤收集细胞；e、液氮反复冻融法破碎细胞收集细胞胞内活性肽：将收集的细细胞进行繁殖培养，收集培养到P10代且呈细小梭型的细胞，胰酶消化后离心收集细胞体后三次梯度离心洗涤收集沉淀物，沉淀物加去离子水，依次进行液氮反复冻融法和低速离心，离心后取上清液进行离心超滤，将超滤后的滤液进行固相萃取，洗脱液由甲醇、水以及甲酸混合组成，得到的洗脱液用氮气吹挥发干净甲醇得到细胞胞内活性肽液；f、采用真空冷冻干燥机对细胞胞内活性肽液进行冻干浓缩得到活性肽冻干粉。作为上述技术方案的优选，在步骤a中，洗涤后的脐带在放入培养皿之前，将脐带挑去血管组织。作为上述技术方案的优选，在步骤c中，冻存的细胞在水浴时需在1min内全部融化。作为上述技术方案的优选，在步骤c和d中，终止消化时，加入的培养基均大于所用胰酶一倍体积。作为上述技术方案的优选，在步骤e中，三次梯度离心洗涤的具体操作是第一次离心在3000～5000rpm下离心15min，去上清，然后收集沉淀物，吹散，加入PBS洗涤液到50毫升，混匀继续进行第二次离心，在3000～5000rpm下离心10min，去上清，然后收集沉淀物，吹散，加入PBS洗涤液到50毫升，混匀继续进行第三次离心，在3000～5000rpm下离心5min，去上清，收集沉淀物，其中第一次离心、第二次离心、第三次离心的转速一致。作为上述技术方案的优选，在步骤e中，沉淀物加去离子水配置成细胞浓度为8*105个/ml的细胞浓度。作为上述技术方案的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：a、细胞胞体培养：将脐带剪成小段并放入含2%双抗的PBS洗液中洗涤2～3次，之后放入培养皿中并剪碎至糊状，加入培养基并搅拌均匀，之后移入培养瓶中并加入培养基，将培养瓶放入CO2培养箱，5～9天后往培养瓶中加入培养基，之后在显微镜下观察到培养瓶局部出现细胞融合度达到90%以上时，用胰酶消化传代并收集；b、将分离得到的间充质干细胞进行鉴定：对胰酶消化后的细胞使用细胞染色缓冲液或PBS洗涤液进行洗涤，之后1000～2000rpm离心细胞悬液5～10min，弃掉上清液后加染色缓冲液制成细胞悬液,将细胞悬液加入流式细胞管中备用，之后对细胞悬液进行封闭Fc受体，并对细胞悬液中加入荧光标记的抗体，混匀后置于冰上，避光孵育30～40min，加入FACs 缓冲液或PBS洗涤液重悬细胞，1000～2000 rpm离心细胞悬液5～10min，弃掉上清液后加入FACs 缓冲液或PBS洗涤液重悬细胞，之后用流式细胞仪碱性检测和分析；c、复苏扩增细胞：将细胞冻存后取出放入37℃水浴锅中，使其全部融化，在放有培养基的离心管内放入解冻的细胞悬液，之后1000～2000rpm离心5～10min并倒去上清液，向离心管中加入培养基吹打均匀，离心洗涤并倒去上清液，加入培养基重悬细胞，转移至培养瓶后放入CO2培养箱培养24～48h，之后吸出培养基加入PBS洗涤液进行洗涤，洗涤完成后吸出洗涤液并加入胰酶，直至肉眼可见贴壁细胞层有大量细胞掉落后加入培养基终止消化，吹打细胞层并吸取细胞悬液于离心管内1000～2000rpm离心5～10min，倒去上清液，再加入培养基重悬、离心洗涤，倒去上清液，加入培养基重悬，转移至培养瓶后放入CO2培养箱培养；d、收集清洗细胞体用于细胞胞内活性肽的提取：观察到培养瓶内的细胞融合度达到85～90%后吸出培养基，加入PBS洗涤液洗涤，洗涤完成后吸出洗涤液并加入胰酶，直至肉眼可见贴壁细胞层有大量细胞掉落后加入培养基终止消化，吹打细胞层并吸取细胞悬液于离心管内1000～2000rpm离心5～10min，倒去上清液，再加入PBS洗涤液重悬、离心洗涤收集细胞；e、液氮反复冻融法破碎细胞收集细胞胞内活性肽：将收集的细胞进行繁殖培养，收集培养到P10代且呈细小梭型的细胞，胰酶消化后离心收集细胞体后三次梯度离心洗涤收集沉淀物，沉淀物加去离子水，依次进行液氮反复冻融法和低速离心，离心后取上清液进行离心超滤，将超滤后的滤液进行固相萃取，洗脱液由甲醇、水以及甲酸混合组成，得到的洗脱液用氮气吹挥发干净甲醇得到细胞胞内活性肽液；f、采用真空冷冻干燥机对细胞胞内活性肽液进行冻干浓缩得到活性肽冻干粉。...

【技术特征摘要】
1.一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：a、细胞胞体培养：将脐带剪成小段并放入含2%双抗的PBS洗液中洗涤2～3次，之后放入培养皿中并剪碎至糊状，加入培养基并搅拌均匀，之后移入培养瓶中并加入培养基，将培养瓶放入CO2培养箱，5～9天后往培养瓶中加入培养基，之后在显微镜下观察到培养瓶局部出现细胞融合度达到90%以上时，用胰酶消化传代并收集；b、将分离得到的间充质干细胞进行鉴定：对胰酶消化后的细胞使用细胞染色缓冲液或PBS洗涤液进行洗涤，之后1000～2000rpm离心细胞悬液5～10min，弃掉上清液后加染色缓冲液制成细胞悬液,将细胞悬液加入流式细胞管中备用，之后对细胞悬液进行封闭Fc受体，并对细胞悬液中加入荧光标记的抗体，混匀后置于冰上，避光孵育30～40min，加入FACs缓冲液或PBS洗涤液重悬细胞，1000～2000rpm离心细胞悬液5～10min，弃掉上清液后加入FACs缓冲液或PBS洗涤液重悬细胞，之后用流式细胞仪碱性检测和分析；c、复苏扩增细胞：将细胞冻存后取出放入37℃水浴锅中，使其全部融化，在放有培养基的离心管内放入解冻的细胞悬液，之后1000～2000rpm离心5～10min并倒去上清液，向离心管中加入培养基吹打均匀，离心洗涤并倒去上清液，加入培养基重悬细胞，转移至培养瓶后放入CO2培养箱培养24～48h，之后吸出培养基加入PBS洗涤液进行洗涤，洗涤完成后吸出洗涤液并加入胰酶，直至肉眼可见贴壁细胞层有大量细胞掉落后加入培养基终止消化，吹打细胞层并吸取细胞悬液于离心管内1000～2000rpm离心5～10min，倒去上清液，再加入培养基重悬、离心洗涤，倒去上清液，加入培养基重悬，转移至培养瓶后放入CO2培养箱培养；d、收集清洗细胞体用于细胞胞内活性肽的提取：观察到培养瓶内的细胞融合度达到85～90%后吸出培养基，加入PBS洗涤液洗涤，洗涤完成后吸出洗涤液并加入胰酶，直至肉眼可见贴壁细胞层有大量细胞掉落后加入培养基终止消化，吹打细胞层并吸取细胞悬液于离心管内1000～2000rpm离心5～10min，倒去上清液，再加入PBS洗涤液重悬、离心洗涤收集细胞；e、液氮反复冻融法破碎细胞收集细胞胞内活性肽：将收集的细胞进行繁殖培养，收集培养到P10代且呈细小梭型的细胞，胰酶消化后离心收集细胞体后三次梯度离心洗涤收集沉淀物，沉淀物加去离子水，依次进行液氮反复冻融法和低速离心，离心后取上清液进行离心超滤，将超滤后的滤液进行固相萃取，洗脱液由甲醇、水以及甲酸混合组成，得到的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周碧柳，李钧翔，陆益，董云加，范元亮，俞剑峰，沈丽霞，
申请(专利权)人：启迪汉洱康嘉兴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33