一种脂肪来源的脂肪干细胞的分离扩增方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种脂肪来源的脂肪干细胞的分离扩增方法，包括脂肪组织选取、酶消化法从脂肪组织中获得脂肪干细胞、扩增脂肪干细胞等步骤，本发明专利技术提供的脂肪干细胞的分离扩增方法细胞扩增速度快、在规定的细胞繁殖代数内，可以得到浓度为1×10

A method for isolation and amplification of adipose-derived stem cells and its application

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪来源的脂肪干细胞的分离扩增方法及其应用
本专利技术涉及一种脂肪来源的脂肪干细胞的分离扩增方法，以及应用该脂肪干细胞制备脂肪注射液用于丰胸。
技术介绍
随着社会的不断进步与发展，人们在充实自己内在的同时对于自己的外表越来越关注，然而，有些女性天生或随着年龄的增长，乳房萎缩变小或松弛下垂，因此通过整形手术进行丰胸就变成女性心中理想的选择。丰胸，也称为隆胸或丰乳，是女性为了提升魅力而针对胸部形状进行塑造的一种行为。常见的丰胸方法有以下几种：食物丰胸，即通过调节饮食规律，借用蔬菜里的营养物质达到丰胸的目的；运动丰胸，通过日常运动刺激胸部发育；药物丰胸，服用药物进行丰胸；假体丰胸，对胸部填充硅胶等制品达到丰胸的目的；自体脂肪注射丰胸，通过吸脂法得到的自体脂肪组织，通过注射进行丰胸。前三种丰胸方式，可在家中完成，但效果因人而异，差别较大。后两种丰胸方式，需在整形医院完成。假体丰胸是将硅胶假体，通过切口置入胸大肌下间隙。该方法损伤部位大，术后恢复期较长，若干年需另行更换，患者的心理经济负担较重，术后需长期按摩乳房、永久性保护乳房不受外伤等等。自体脂肪注射丰胸容易出现脂肪液化、坏死等并发症，造成不良后果。综上所述，目前使用的方法都不能安全、有效的从根本上解决所有人的丰胸问题。干细胞是一类具有自我更新，多向分化的多潜能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。其中脂肪干细胞（adiposderivedMesnchymalstemcells，ADSCs）来自于脂肪组织，相比于其他干细胞，ADSCs具有以下五方面的显著优势：（一）来源丰富，取材容易。（二）易于扩增，不易衰老。实验证明，多次传代后细胞生长速度也无减慢趋势，可继续保持结构和功能上的稳定性。（三）具有旁分泌功能，可分泌促进血管生成的相关因子，促进血管再生。（四）具有较低的免疫原性。（五）ADSCs经血液系统进入人体以后，具有很好的调理全身的作用，可以显著地提高机体的灵活性及耐受性、调节机体的内分泌水平并改善神经系统对机体的支配功能。目前从脂肪组织中分离脂肪干细胞的基本方法是：首先，对所获得的脂肪组织样品进行洗涤，除去血细胞；其次，进行脂肪破碎、消化，去掉其他杂细胞；再次，除去未消化的组织，获得含脂肪干细胞的滤液；最后，离心得到脂肪干细胞，可用于后续的培养、传代以及冻存等。该基本方法所面临的技术难题包括：不能使用胎牛血清进行细胞扩增，使得继代增殖速度缓慢，无法在规定的代数内，得到需要数量的脂肪干细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种脂肪来源的脂肪干细胞的分离扩增方法以解决上述培养方法中细胞扩增速度慢、在规定的细胞繁殖代数内，无法得到需要数量的脂肪干细胞等技术问题，并提供一种应用该脂肪干细胞用于丰胸的脂肪注射液。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种脂肪来源的脂肪干细胞的分离扩增方法，包括如下步骤：（1）脂肪组织选取：在无菌条件下从大腿内侧或腹部抽取脂肪组织20～30ml；（2）酶消化法从脂肪组织中获得脂肪干细胞：在超净工作台无菌环境下，在抽取的脂肪组织中，加入两倍体积的1～5mg/mLI型胶原蛋白酶，37度下消化1h，将消化液在800转离心下，离心5分钟，弃上清液，用含有EGF、bFGF及PRP的DMEM/F12培养基重悬细胞；（3）扩增脂肪干细胞：在DMEM/F12培养基中加入碱性细胞生长因子EGF、bFGF及富含血小板的血浆，在35～37℃、浓度1～5%二氧化碳培养箱中培养脂肪干细胞，所述碱性细胞生长因子的浓度为：EGF活力单位为50～200U/mL，bFGF活力单位为100～500U/mL，所述富含血小板的血浆，是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，将其加入DMEM/F12培养基中，其血浆最终浓度为5～20%。基于以上技术方案，本专利技术提供的脂肪干细胞的分离扩增方法，一种较优的方法，包括如下步骤：1）无菌条件下，从大腿内侧或腹部抽取脂肪组织，按体积比例1:2加入5mg/mL的I型胶原蛋白酶，37度下消化1h，将消化液在800转离心下，离心5分钟，弃上清液；2）用含有EGF、bFGF及PRP的DMEM/F12培养基重悬细胞，在37度、5%二氧化碳浓度下，在培养箱中培养8天，其中EGF活力单位为50U/mL，bFGF活力单位为100U/mL，PRP的浓度为10%。本专利技术还提供一种上述方法制备的脂肪干细胞的应用，将扩增的脂肪干细胞与新鲜脂肪组织混匀，制备成脂肪注射液，其制备成的脂肪注射液中脂肪干细胞的终浓度为1×106细胞/ml。需要说明的是，本专利技术在基础培养基中加入自体富含血小板的血浆（PRP）、表皮细胞生长因子（EGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），用于脂肪干细胞的扩增，自体富含血小板的血浆含有丰富的生长因子，即血小板衍生生长因子、转化生长因子β1与β2、类胰岛素生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、上皮细胞生长因子等。同时添加生长因子，EGF及bFGF将更好地对脂肪干细胞进行扩增。本专利技术提供的脂肪干细胞的分离扩增方法细胞扩增速度快、在规定的细胞繁殖代数内，可以得到浓度为1×106细胞/ml的脂肪干细胞，并提供一种应用该脂肪干细胞用于丰胸的脂肪注射液，可有效解决单纯脂肪注射时，出现的脂肪液化、坏死等并发症，脂肪干细胞注射后，能产生多种细胞因子，如血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、类胰岛素生长因子、血小板衍生因子和转化生长因子等，这些生长因子不但可促进血管再生，而且可改善新注入脂肪组织的微环境，保证新注入脂肪组织的营养供给，使其成活，完成丰胸及胸部的重塑。具有丰胸效果自然、圆润，无毒副作用等特点。采用自体脂肪干细胞丰胸，仅需一次性移植即可达到丰胸之功效。该法创伤小，负担轻，无明显切口，安全有效；同时在抽取自体脂肪作为丰胸材料的同时，还可以瘦身美体。附图说明图1表示，最佳NGF浓度的筛选曲线图；图2表示，最佳bFGF浓度的筛选曲线图；图3表示，在相同的培养条件下，不同培养基培养的脂肪干细胞生长曲线。具体实施方式1材料和方法1.1材料抽取腹部或大腿内侧的脂肪组织20～30ml，由西安丽樽整形医院提供；I型胶原蛋白、EGF、bFGF购自sigma；DMEM/F12，FBS购自Gibco；细胞计数试剂盒购自西安赫特生物科技有限公司；脂肪干细胞的无血清培养基购自STEMCELL；PRP为自体全血经离心后得到的血小板浓缩物。1.2用EXCEL统计软件分析，进行方差分析，当p＜0.05时，差异具有统计学意义。实施例1：脂肪干细胞分离培养。在手术室内，取腹部或大腿内侧脂肪20～30ml，将其保存于无菌生理盐水中，用冷链运输至实验室。在GMP实验室的百级超净工作台上，在脂肪组织中，按1:2的体积比加入5mg/mLI型胶原蛋白，在37度下消化1h，将消化液800转离心5分钟，弃上清液，用含有EGF、bFGF及PRP的DMEM/F12培养基重悬细胞，加入至T25细胞培养瓶中，在37度，5%二氧化碳培养箱中培养至P1代。实施例2：将实验分为五组，A组（DMEM/F12+10%PRP+10U/mLEGF）、B组（DMEM/F12+10%PRP+20U/mLEGF）、C组（DMEM/F12+10%PRP+50U/mLEGF）、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肪来源的脂肪干细胞的分离扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：脂肪组织选取：在无菌条件下从大腿内侧或腹部抽取脂肪组织20～30ml；酶消化法从脂肪组织中获得脂肪干细胞：在超净工作台无菌环境下，在抽取的脂肪组织中，加入两倍体积的1～5mg/mL I型胶原蛋白酶，37度下消化1h，将消化液在800转离心下，离心5分钟，弃上清液，用含有EGF、bFGF及PRP的DMEM/F12培养基重悬细胞；扩增脂肪干细胞：在DMEM/F12培养基中加入表皮细胞生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及富含血小板的血浆（PRP），在35～37℃、浓度1～5%二氧化碳培养箱中培养脂肪干细胞，所述碱性细胞生长因子的浓度为：EGF活力单位为50～200U/mL，bFGF活力单位为100～500U/mL，所述富含血小板的血浆，是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，将其加入DMEM/F12培养基中，其血浆最终浓度为5～20%。

【技术特征摘要】
1.一种脂肪来源的脂肪干细胞的分离扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：脂肪组织选取：在无菌条件下从大腿内侧或腹部抽取脂肪组织20～30ml；酶消化法从脂肪组织中获得脂肪干细胞：在超净工作台无菌环境下，在抽取的脂肪组织中，加入两倍体积的1～5mg/mLI型胶原蛋白酶，37度下消化1h，将消化液在800转离心下，离心5分钟，弃上清液，用含有EGF、bFGF及PRP的DMEM/F12培养基重悬细胞；扩增脂肪干细胞：在DMEM/F12培养基中加入表皮细胞生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及富含血小板的血浆（PRP），在35～37℃、浓度1～5%二氧化碳培养箱中培养脂肪干细胞，所述碱性细胞生长因子的浓度为：EGF活力单位为50～200U/mL，bFGF活力单位为100～500U/mL，所述富含血小板的血浆，是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建强，何晓，艾霞，
申请(专利权)人：西安洛威塔生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61