检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法技术

本发明专利技术公开了检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，包括：步骤一、制备碳量子点并将其配制成碳量子点溶液；步骤二、制备不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液，并分别向其中加入乙酰胆碱溶液、胆碱氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液和邻苯二胺溶液，得混合液系；步骤三、分别向混合液系中加入碳量子点溶液，得标准样品系；步骤四、分别检测标准样品系在442nm处和573nm处的荧光强度I442和I573，建立I573/I442与乙酰胆碱酯酶浓度之间的线性关系式；步骤五、配制乙酰胆碱酯酶待测溶液，参照步骤二、三、四，获得乙酰胆碱酯酶待测溶液中的乙酰胆碱酯酶的浓度。本发明专利技术具有能进行样品中乙酰胆碱酯酶的高灵敏识别等优点。

Detection of Acetylcholinesterase Concentration

【技术实现步骤摘要】
检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法
本专利技术涉及乙酰胆碱酯酶检测领域。更具体地说，本专利技术涉及一种检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法。
技术介绍
乙酰胆碱酯酶主要分布于神经系统组织中，能够快速的催化水解神经递质乙酰胆碱而导致神经冲动传递的终止，从而使人体的正常生理功能得到保证。人类的脑组织中含有大量的乙酰胆碱，其含量会随着年纪的增加而下降，当大脑中乙酰胆碱的含量太低时，就会得阿尔茨海默病。目前，国内外对乙酰胆碱酯酶的检测方法主要有化学发光法、荧光法、分光光度法以及电化学方法等。但大多数方法存在操作方法复杂、反应时间长、灵敏度不高等缺陷。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其利用碳量子点作为荧光探针检测溶液中乙酰胆碱酯酶浓度，操作简单、检测快速且灵敏度高，能进行样品中乙酰胆碱酯酶的高灵敏识别。为了实现根据本专利技术的目的和其它优点，提供了一种检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，包括：步骤一、制备碳量子点并将其配制成碳量子点溶液；步骤二、制备不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液，并分别向其中加入相同体积的乙酰胆碱溶液、胆碱氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液和邻苯二胺溶液，混合反应后，得混合液系；步骤三、分别向所述混合液系中加入相同体积的所述碳量子点溶液，混合反应后，得标准样品系；步骤四、分别检测所述标准样品系在442nm处和573nm处的荧光强度I442和I573，建立I573/I442与乙酰胆碱酯酶浓度之间的线性关系式；步骤五、配制与步骤二中的乙酰胆碱酯酶标准溶液体积相同浓度未知的乙酰胆碱酯酶待测溶液，参照步骤二、三，制得待测样品并测定其荧光强度I442和I573，根据I573/I442与乙酰胆碱酯酶浓度之间的线性关系式，即可计算出所述乙酰胆碱酯酶待测溶液中的乙酰胆碱酯酶的浓度。优选的是，所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，步骤一中，碳量子点的制备方法为：取木炭1g和200mL浓度为5mmoL的HNO3溶液，混匀后，在120℃油浴下磁力搅拌回流8h，将回流后的反应液过滤，得到上清液；用NaOH溶液调节所述上清液的pH值至中性，再过滤，取滤下物，冷冻干燥，即得。优选的是，所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，所述碳量子点溶液的浓度为5.3×10-6g/mL，所述不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液的浓度分别为0U/L、2U/L、5U/L、10U/L、25U/L，所述乙酰胆碱溶液的浓度为1.2×10-3mol/L，所述胆碱氧化酶溶液的浓度为4U/mL，所述辣根过氧化物酶溶液的浓度为1×10-5g/mL，所述邻苯二胺溶液的浓度为3×10-2mol/L，且上述溶液均采用Tris-HCl缓冲溶液配制，所述Tris-HCl缓冲溶液的pH为7.4、浓度为0.05mol/L。优选的是，所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，所述不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液的具体配制方法为：先利用乙酰胆碱酯酶干粉配置浓度为1000U/L的原液，再将所述原液用所述Tris-HCl缓冲液进行梯度稀释，即得。优选的是，所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，步骤二中，混合反应的条件为：反应温度37℃、反应时间30min。优选的是，所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，步骤三中，混合反应的条件为：反应温度25℃，反应时间1min，反应过程中使用微量进样器进行搅拌。优选的是，所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，步骤四中，荧光检测的条件为：激发波长为380nm，激发和发射狭缝均为5nm。本专利技术的有益效果是：本专利技术利用乙酰胆碱酯酶会把乙酰胆碱水解，水解产物为胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的作用下产生过氧化氢，而辣根过氧化物酶与过氧化氢相互作用后生成具有强氧化性的羟基自由基，将邻苯二胺氧化成2,3-二氨基吩嗪，2,3-二氨基吩嗪能通过内部过滤效应猝灭碳量子点的荧光，而2,3-二氨基吩嗪本身也具有一定强度的荧光，由此可以通过两者的荧光强度比值构建比率型检测体系检测乙酰胆碱酯酶的含量，检测过程简单方便，灵敏度高、检测限低，可实现混合样品中乙酰胆碱酯酶的快速灵敏检测，本专利技术公开的方法对乙酰胆碱酯酶的检测限可达到0.95U/L。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1是根据本专利技术一个实施例的所述标准样品系在激发波长为380nm时得到的荧光光谱图；图2是根据本专利技术一个实施例中以乙酰胆碱酯酶浓度为横坐标，I573/I442为纵坐标绘制的标准曲线图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1：制备碳量子点：取木炭1g和200mL浓度为5mmoL的HNO3溶液，混匀后，在120℃油浴下磁力搅拌回流8h，将回流后的反应液过滤，得到上清液；用NaOH溶液调节所述上清液的pH值至中性，用0.22μm的微孔滤膜过滤，取滤下物，冷冻干燥，即得。实施例2：一种检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，包括：步骤一、将2g的胰酶溶于10ml的超纯水中，分散后，将其放入20ml反应釜中，于180℃下反应10h后，取出，冷冻干燥，制得碳量子点，将所述碳量子点用的pH为7.4、浓度为0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液配制为浓度为5.3×10-6g/mL的碳量子点溶液；步骤二、先用乙酰胆碱酯酶干粉和超纯水配置浓度为1000U/L的原液，将所述原液用所述Tris-HCl缓冲液进行梯度稀释，制得不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液，其浓度依次为0U/L、2U/L、5U/L、10U/L、25U/L，再分别向100μl所述不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液中加入100μl浓度为1.2×10-3mol/L的乙酰胆碱溶液，100μl浓度为4U/mL的胆碱氧化酶溶液，100μl浓度为1×10-5g/mL的辣根过氧化物酶溶液和100μl浓度为3×10-2mol/L的邻苯二胺溶液，于37℃下反应时间30min，得混合液系，其中，所述乙酰胆碱溶液、胆碱氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液和邻苯二胺溶液均用所述Tris-HCl缓冲溶液配制；步骤三、分别向所述混合液系中加入100μl的所述碳量子点溶液，于25℃下反应1min，反应过程中使用微量进样器进行搅拌，得标准样品系；步骤四、用RF-6000荧光分光光度计，设定激发波长为380nm，激发和发射狭缝均为5nm，分别检测所述标准样品系在442nm处和573nm处的荧光强度I442和I573，得到所述标准样品系在激发波长为380nm时得到的荧光光谱图，如图1所示，其中，I442为碳点的荧光，I573为2,3-二氨基吩嗪的荧光，曲线a、b、c、d、e对应的乙酰胆碱酯酶标准溶液的浓度依次为0U/L、2U/L、5U/L、10U/L、25U/L，再以乙酰胆碱酯酶浓度为横坐标，I573/I442为纵坐标绘制的标准曲线图，如图2所示，得到乙酰胆碱酯酶浓度与I573/I442具有良好的线性关系，线性方程为I573/I442＝0.063×c乙酰胆碱酯酶+0.17，R2＝0.997；步骤五、配制与步骤二中的乙酰胆碱酯酶标准溶液体积相同浓度未知的乙酰胆碱酯酶待测溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在于，包括：步骤一、制备碳量子点并将其配制成碳量子点溶液；步骤二、制备不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液，并分别向其中加入相同体积的乙酰胆碱溶液、胆碱氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液和邻苯二胺溶液，混合反应后，得混合液系；步骤三、分别向所述混合液系中加入相同体积的所述碳量子点溶液，混合反应后，得标准样品系；步骤四、分别检测所述标准样品系在442nm处和573nm处的荧光强度I442和I573，建立I573/I442与乙酰胆碱酯酶浓度之间的线性关系式；步骤五、配制与步骤二中的乙酰胆碱酯酶标准溶液体积相同浓度未知的乙酰胆碱酯酶待测溶液，参照步骤二、三，制得待测样品并测定其荧光强度I442和I573，根据I573/I442与乙酰胆碱酯酶浓度之间的线性关系式，即可计算出所述乙酰胆碱酯酶待测溶液中的乙酰胆碱酯酶的浓度。

【技术特征摘要】
1.检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在于，包括：步骤一、制备碳量子点并将其配制成碳量子点溶液；步骤二、制备不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液，并分别向其中加入相同体积的乙酰胆碱溶液、胆碱氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液和邻苯二胺溶液，混合反应后，得混合液系；步骤三、分别向所述混合液系中加入相同体积的所述碳量子点溶液，混合反应后，得标准样品系；步骤四、分别检测所述标准样品系在442nm处和573nm处的荧光强度I442和I573，建立I573/I442与乙酰胆碱酯酶浓度之间的线性关系式；步骤五、配制与步骤二中的乙酰胆碱酯酶标准溶液体积相同浓度未知的乙酰胆碱酯酶待测溶液，参照步骤二、三，制得待测样品并测定其荧光强度I442和I573，根据I573/I442与乙酰胆碱酯酶浓度之间的线性关系式，即可计算出所述乙酰胆碱酯酶待测溶液中的乙酰胆碱酯酶的浓度。2.如权利要求1所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在于，步骤一中，碳量子点的制备方法为：取木炭1g和200mL浓度为5mmoL的HNO3溶液，混匀后，在120℃油浴下磁力搅拌回流8h，将回流后的反应液过滤，得到上清液；用NaOH溶液调节所述上清液的pH值至中性，再过滤，取滤下物，冷冻干燥，即得。3.如权利要求1所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄珊，肖琦，姚建东，刘义，
申请(专利权)人：南宁师范大学，
类型：发明
国别省市：广西,45