双受体时间分辨时间分辨荧光共振能量转移法制造技术

本发明专利技术提供了使用双受体时间分辨性荧光共振能量转移法确定样品中是否存在多种分析物的方法。

Dual-receptor time-resolved fluorescence resonance energy transfer method

【技术实现步骤摘要】
双受体时间分辨时间分辨荧光共振能量转移法本申请是国际申请日为2013年02月6日的申请号为201380015407.5的中国专利技术专利申请“双受体时间分辨时间分辨荧光共振能量转移法”的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求于2012年2月6日提交的第61/595,459号美国申请的权益，这里通过引用将其全部内容整体并入本文。
本专利技术涉及利用时间分辨荧光共振能量转移法(time-resolvedfluorescenceresonanceenergytransfer)确定样品中是否存在一种或多种分析物的多重测定。
技术介绍
时间分辨荧光共振能量转移法(TR-FRET)应用是基于给体(donor)和受体(acceptor)分子之间的能量传递。FRET是从荧光给体分子至合适的受体分子的非辐射能量转移。如果紧邻受体分子且给体分子的发射光谱和受体分子的激发光谱重叠，那么给体分子能够使其激发能量转移至受体分子，而不是发射荧光。接着，受体分析会在受体发射波长下发射荧光。出现受体发射波长的荧光表明给体和受体分子彼此紧邻，给体和受体分子需要相隔小于约20nm，例如相隔5～10nm，以发生能量转移。通常，通过生物亲和性相互作用，例如蛋白质-蛋白质结合、抗原-抗体结合、配体-受体结合、DNA杂交和DNA-蛋白质结合，实现给体和受体分子的紧密靠近。存在多种给体和受体分子。通常，用于FRET测定中的给体和受体分子是具有短半衰期的荧光基团。通过来自样品组分例如缓冲液、蛋白质、化合物和细胞溶胞产物的背景荧光能够降低常规FRET化学的性能。必须校正这种自荧光(auto-fluorescence)的检测后的荧光强度，该自荧光降低测定灵敏度，并且能够使结果翻译复杂化。这种类型的背景荧光是短暂的(具有纳秒范围内的寿命)，并且因此使用时间分辨方法能够加以消除。TR-FRET利用镧系元素的离子例如铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)、镝(Dy)的离子的特有性质。鉴于它们特定的光物理和光谱性质，稀土离子的络合物对生物学中的荧光应用是感兴趣的。具体地，当和更常见的荧光基团相比时，它们具有大的斯托克斯位移和长发射半衰期(从微秒至毫秒)。通过直接激发产生镧系元素离子的荧光是困难的，因为这些离子具有较差的吸光能力。镧系元素必须首先和有机部分(organicmoieties)络合，该有机部分捕获光并通过分子内的非辐射过程将光转移至镧系元素。稀土元素的螯合物和穴合物是集光部分的实例。所收集的能量被转移至稀土离子，其然后发射它特有的长寿命荧光。镧系元素螯合物常常也具有高量子产率，从而使少量给体产生光亮信号，因此提高了灵敏度。此外，它们的发射峰是相当窄的，从而对受体发射光的干扰很小。用于技术平台的重要金属中的一个是铕(在约315～350nm下激发，而在约600～635nm下发射)。
技术实现思路
本专利技术是至少部分基于TR-FRET的新方法。铕发射至少一种波长的能量。不计杂峰，它具有两个主要的发射峰：一个峰在约600～635nm，而另一个在约675～715nm(图1)。该观测结果增大了具有两个存在于TR-FRET测定中的受体分子的概率：将与600～635nm的发射峰相互作用的一个，和将与675～715nm的反射峰相互作用的一个。因此，一种镧系元素螯合剂受体允许检测样品中的分析物或变体(modification)的两种同时测定。一方面，本专利技术提供了独立确定样品中是否存在两种分析物的方法。该方法包括使样品接触第一分析物特异性的结合配偶体(analyte-specificbindingpartner)和第二分析物特异性的结合配偶体，其中该第一和第二分析物特异性的结合配偶体分别接合(conjugate)镧系元素螯合剂部分；使样品暴露于能够激发在第一和第二分析物特异性的结合配偶体中的螯合剂中的镧系元素的波长范围内的光；以及，独立确定第一分析物特异性的结合配偶体和第二分析物特异性的结合配偶体是否分别结合第一分析物和第二分析物，由此独立确定样品中的这两种分析物是否存在。另一方面，本专利技术特征在于确定酶对两种不同的底物是否具有活性的方法。该方法包括提供包含两种不同底物的样品；在足以从第一底物中产生第一分析物且从第二底物中产生第二分析物的条件下，使该样品和酶接触；使该样品接触第一分析物特异性的结合配偶体和第二分析物特异性的结合配偶体；其中第一和第二分析物特异性的结合配偶体分别接合镧系元素螯合剂部分；使样品暴露于能够激发第一和第二分析物特异性的结合配偶体中螯合剂中的镧系元素的波长范围内的光；以及，独立确定第一分析物特异性的结合配偶体和第二分析物特异性的结合配偶体是否分别结合第一分析物和第二分析物，由此确定酶是否对第一和第二底物具有活性。又一方面，本专利技术提供了确定两种酶是否独立地对底物具有活性的方法。该方法包括：提供包含底物的样品；在足以用第一酶产生第一分析物和用第二酶产生第二分析物的条件下，使样品接触两种不同的酶；使样品接触第一分析物特异性的结合配偶体和第二分析物特异性的结合配偶体，其中第一和第二分析物特异性的结合配偶体分别接合镧系元素螯合剂部分；使样品暴露于能够激发第一和第二分析物特异性的结合配偶体中螯合剂的镧系元素的波长范围内的光；以及，独立地确定第一分析物特异性的结合配偶体和第二分析物特异性的结合配偶体是否分别结合第一分析物和第二分析物，由此独立地确定第一和第二酶对底物的活性。一方面，本专利技术特征在于独立地确定样品中是否存在两种分析物的方法。该方法可以包括使该样品接触结合第一荧光能量共振转移(FRET)受体的第一分析物特异性的结合配偶体、结合第二FRET受体的第二分析物特异性的结合配偶体和包含镧系元素螯合物配偶体的化合物；使样品暴露于能够激发螯合剂中的镧系元素的波长范围内的光；以及，独立地确定第一分析物特异性的结合配偶体和第二分析物特异性的结合配偶体分别结合第一分析物和第二分析物，由此独立地检测样品中是否存在这两种分析物。在一些实施方式中，第一和第二分析物分别包含亲和标记物，而具有镧系元素螯合部分的化合物进一步包括亲和标记物特有的结合配偶体。又一方面，本文描述了独立地确定两种酶是否对底物具有活性的方法。该方法包括：提供包含底物的样品，其中该底物标记有亲和标记物；在足以用第一酶产生第一分析物和用第二酶产生第二分析物条件下，使该样品接触两种不同的酶；使该样品接触具有镧系元素螯合部分的亲和标记物特有的结合配偶体；使该样品接触第一分析物特异性的结合配偶体和第二分析物特异性的结合配偶体，其中第一和第二分析物特异性的结合配偶体分别接合能够由波长为约600～635nm的光激发的检测部分和能够由波长为约675～715nm的光激发的另一检测部分；使该样品暴露于能够激发螯合物中镧系元素的波长范围内的光；以及，独立地确定第一分析物特异性的结合配偶体和第二分析物特异性的结合配偶体是否分别结合第一分析物和第二分析物，由此独立地确定第一和第二酶对底物的活性。在一些实施方式中，两种螯合部分的镧系元素是相同的。在一个实施方式中，接合的螯合部分(conjugatedchelatemoiety)在两种结合配偶体中是相同的。能够使用任何合适的镧系元素螯合部分。在一些实施方式中，螯合部分可以选自吡啶、联吡啶、三吡啶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.独立地确定样品中是否存在两种分析物的方法，其包括：使所述样品接触第一分析物特异性的结合配偶体和第二分析物特异性的结合配偶体，其中所述的第一和第二分析物特异性的结合配偶体分别和镧系元素螯合物部分偶联；使所述样品暴露于能够激发所述的第一和第二分析物特异性的结合配偶体中螯合物的镧系元素的波长范围内的光下；和独立地确定是否所述第一分析物特异性的结合配偶体和所述第二分析物特异性的结合配偶体分别结合所述第一分析物和所述第二分析物，从而独立地确定所述样品中是否存在所述两种分析物。

【技术特征摘要】
2012.02.06 US 61/595,4591.独立地确定样品中是否存在两种分析物的方法，其包括：使所述样品接触第一分析物特异性的结合配偶体和第二分析物特异性的结合配偶体，其中所述的第一和第二分析物特异性的结合配偶体分别和镧系元素螯合物部分偶联；使所述样品暴露于能够激发所述的第一和第二分析物特异性的结合配偶体中螯合物的镧系元素的波长范围内的光下；和独立地确定是否所述第一分析物特异性的结合配偶体和所述第二分析物特异性的结合配偶体分别结合所述第一分析物和所述第二分析物，从而独立地确定所述样品中是否存在所述两种分析物。2.确定酶对两种不同的底物是否具有活性的方法，其包括：提供包含两种不同底物的样品；在足以从所述第一底物产生第一分析物并且从所述第二底物产生第二分析物的条件下，使所述样品和酶接触；使所述样品接触第一分析物特异性的结合配偶体和第二分析物特异性的结合配偶体，其中所述第一和第二分析物特异性的结合配偶体分别和镧系元素螯合物部分偶联；使所述样品暴露于能够激发所述第一和第二分析物特有的结合部分中螯合物的镧系元素的波长范围内的光；以及独立地确定所述第一分析物特异性的结合配偶体和所述第二分析物特异性的结合配偶体是否分别结合所述第一分析物和所述第二分析物，由此确定所述酶是否对所述第一底物和所述第二底物具有活性。3.确定两种酶是否独立地对底物具有活性的方法，其包括：提供包含底物的样品；在足以用第一酶产生第一分析物并且用第二酶产生第二分析物的条件下使所述样品和两种不同的酶接触；使所述样品接触第一分析物特异性的结合配偶体和第二分析物特异性的结合配偶体，其中所述第一和第二分析物特异性的结合配偶体分别和镧系元素螯合物部分偶联；使所述样品暴露于能够激发所述的第一和第二分析物特异性的结合配偶体的螯合物中的镧系元素的波长范围内的光；以及分别独立地确定是否所述第一分析物特异性的结合配偶体和所述第二分析物特异性的结合配偶体结合所述第一分析物和所述第二分析物，从而独立地确定所述第一酶和所述第二酶对所述底物的活性。4.独立地确定样品中是否存在两种分析物的方法，其包括：使所述样品接触结合有第一荧光能量共振转移(FRET)受体的第一分析物特异性的结合配偶体、结合有第二FRET受体的第二分析物特异性的结合配偶体和具有镧系元素螯合物部分的化合物；使所述样品暴露于能够激发所述的第一和第二分析物特异性的结合配偶体的螯合物中的镧系元素的波长范围内的光；以及分别独立地确定是否所述第一分析物特异性的结合配偶体和所述第二分析物特异性的结合配偶体结合所述第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：P罗比，B伯恩德，S达汉，
申请(专利权)人：珀金埃尔默生物信号股份有限公司，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA