一种赭曲霉毒素的检测试剂盒及其检测赭曲霉毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种赭曲霉毒素的检测试剂盒及其检测赭曲霉毒素的方法，属于有害物质检测技术领域。本发明专利技术赭曲霉毒素的检测试剂盒，包括赭曲霉毒素的核酸适配体、与该核酸适配体不完全互补的cDNA、两个发卡序列H1和H2；其中，所述赭曲霉毒素的核酸适配体的序列如序列表SEQ ID NO.1所示；所述两个发卡序列H1和H2能够自组装成长链；所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA能够触发发卡序列H1和H2的自组装。本发明专利技术提供的试剂盒，具有很高的灵敏度与特异性，操作简单，检测快速，结果肉眼可见，适合所有实验室进行推广，无需专业培训即可实现对赭曲霉毒素的实时现场分析。

A test kit for ochratoxin and its method for detection of ochratoxin

【技术实现步骤摘要】
一种赭曲霉毒素的检测试剂盒及其检测赭曲霉毒素的方法
本专利技术属于有害物质检测
，具体涉及一种赭曲霉毒素的检测试剂盒及其检测赭曲霉毒素的方法。
技术介绍
赭曲霉毒素是属于真菌毒素组的天然污染物，由各种真菌类型的曲霉菌和青霉菌产生。赭曲霉毒素A(ochratoxinA，OTA)作为一种霉菌毒素，20世纪60年代在南非的玉米粉中被发现。多年的研究表明，OTA具有肾毒性、肝毒性、胚胎毒性、致畸性、神经毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌性。在6种已知的赭曲霉毒素类型中，赭曲霉毒素A显示出最高的毒性。国际癌症研究机构(IntemationalAgencyforResearchonCancer，IARC)根据几项动物研究中发现的大量致癌性证据，将OTA列为可能的人类致癌物(2B类)。由于OTA在自然界广泛存在，且性质非常稳定，不容易代谢，研究者陆续在动物肾脏、肝脏、猪肉、猪血、香肠、风干肉等动物源性食品中检测出OTA。国内相关检测方法主要有：GB5009.96-2016、LS/T6126-2017、SN/T4675.10-2016等，但是这些标准中都没有针对动物源性食品的检测方法。所以加快国家方法标准的建立非常必要。同时，国内也暂时没有制定动物源食品OTA限量要求，但是部分国家已经有了相关规定，丹麦规定猪肾脏及血液中最高允许量为10μg/kg和25μg/mL，罗马尼亚规定猪肉、肝脏及猪肾中不超过5μg/kg，意大利规定猪肉及熟肉制品中不超过lμg/kg。目前动物源性食品中OTA的检测方法有薄层色谱法、液相色谱法、毛细管电泳一二极管阵列检测法、液相色谱一串联质谱法、酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析技术等。其中液相色谱和液相色谱。串联质谱法是目前比较主流的检测手段，而酶联免疫法虽然重现性差，但是操作简单、灵敏度较高，所以比较适合大批量样品的检测或初筛。从检测方法来看，虽然酶联免疫法是快速筛查OTA污染的理想手段，但是其特异性稍差，容易产生假阳性，目前利用HPLC荧光检测器对动物源性食品进行定量分析仍然是主流。根据样品基质的不同，其提取手段稍有差别，选择合适的提取溶剂、调节pH值、加入蛋白水解酶、OTA甲酯化、加入脱脂步骤都被证明可以有效提高回收率和重现性。利用LC/MS/MS的高特异性和灵敏度，研究者可以建立多种组分毒素分析方法进一步提高检测准确性和检测效率。对样品净化来说，商品化的免疫亲和柱是目前多数研究人员的首选，虽然其价格昂贵、保存要求高、上样量有限制，但其特异性强，可以更有效去除干扰物质，这对于痕量分析是非常有利的。核酸适配体(Aptamer)是一段寡核苷酸，通过体外人工进化程序(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,SELEX)筛选得到，它可以高效、特异地结合各种配体，如蛋白、小分子化合物、细胞等，特异性如同抗体一样。由于它的易合成、易储存和易修饰等优点，在医学诊断治疗、药物分子设计及分析检测中具有良好的应用前景。但是，如何将核酸适配体更好的应用于赭曲霉毒素的检测之中，需要进一步的探索和研究。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供用于检测赭曲霉毒素的试剂盒，以及检测赭曲霉毒素的方法，以缓解现有技术中存在的赭曲霉毒素检测灵敏度低、操作不便的技术问题。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案为：一种赭曲霉毒素的检测试剂盒，包括赭曲霉毒素的核酸适配体、与该核酸适配体不完全互补的cDNA、两个发卡序列H1和H2；其中，所述赭曲霉毒素的核酸适配体的序列如序列表SEQIDNO.1所示；所述两个发卡序列H1和H2能够自组装成长链；所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA能够触发发卡序列H1和H2的自组装。在上述方案的基础上，所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA一端具有与发卡序列H1环部序列互补的序列；这段序列通过与发卡序列H1的环部序列互补配对，打开发卡序列H1的茎环结构，以此触发发卡序列H1和H2的自组装。在上述方案的基础上，所述发卡序列H1的茎部序列与发卡序列H2的环部序列互补，被打开的发卡序列H1通过序列互补打开发卡序列H2的茎环结构；发卡序列H2的茎部序列与发卡序列H1环部序列完全互补或不完全互补；被打开的发卡序列H2通过序列互补进一步打开另一个发卡序列H1的茎环结构；以此完成自组装过程。在上述方案的基础上，所述发卡序列H1和H2的3’端和5’端分别具有能够形成G-四聚体结构的部分前体核苷酸序列。在上述方案的基础上，所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA与所述赭曲霉毒素核酸适配体之间不互补的碱基个数为3-7个。在上述方案的基础上，所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA序列如序列表SEQIDNO.2所示。在上述方案的基础上，所述发卡序列H1和H2的序列如序列表SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。在上述方案的基础上，所述赭曲霉毒素的检测试剂盒还包括高铁血红素和过氧化物酶HRP的催化底物。一种赭曲霉毒素的检测方法，步骤为：(1)将赭曲霉毒素核酸适配体和与该核酸适配体不完全互补的cDNA混合后，95℃水浴5min后，置于室温自然冷却，使两者通过核酸互补配对形成双链；(2)向体系中加入待测样品，室温反应30min，使得赭曲霉毒素与双链中的赭曲霉毒素核酸适配体结合并打开双链结构；使与该核酸适配体不完全互补的cDNA游离成单链；(3)向2)中反应体系中加入发卡序列H1和H2的混合液，室温反应1小时，进行自组装反应；(4)向3)中反应体系中加入高铁血红素，室温反应10min；(5)向4)中反应体系中加入过氧化物酶HRP的催化底物，室温反应5-10分钟，终止反应；其中，所述赭曲霉毒素的核酸适配体的序列如序列表SEQIDNO.1所示；所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA一端具有与发卡序列H1环部序列互补的序列；这段序列通过与发卡序列H1的环部序列互补配对，打开发卡序列H1的茎环结构，以此触发发卡序列H1和H2的自组装；所述发卡序列H1的茎部序列与发卡序列H2的环部序列互补，被打开的发卡序列H1通过序列互补打开发卡序列H2的茎环结构；发卡序列H2的茎部序列与发卡序列H1环部序列完全互补或不完全互补；被打开的发卡序列H2通过序列互补进一步打开另一个发卡序列H1的茎环结构；以此完成自组装过程；所述发卡序列H1和H2的3’端和5’端分别具有能够形成G-四聚体结构的部分前体核苷酸序列；所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA与所述赭曲霉毒素核酸适配体之间不互补的碱基个数为3-7个。在上述方案的基础上，所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA序列如序列表SEQIDNO.2所示；所述发卡序列H1和H2的序列如序列表SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。本专利技术技术方案的优点：本专利技术提供的核酸适配体，能够特异性的识别赭曲霉毒素，能够用于赭曲霉毒素的检测；本专利技术提供的试剂盒，具有很高的灵敏度与特异性，操作简单，检测快速，结果肉眼可见，适合所有实验室进行推广，无需专业培训即可实现对赭曲霉毒素的实时现场分析。附图说明图1本专利技术检测方法的原理图；图2为不同浓度的靶标赭曲霉毒素的检测结果图；图3为赭曲霉毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：包括赭曲霉毒素的核酸适配体、与该核酸适配体不完全互补的cDNA、两个发卡序列H1和H2；其中，所述赭曲霉毒素的核酸适配体的序列如序列表SEQ ID NO.1所示；所述两个发卡序列H1和H2能够自组装成长链；所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA能够触发发卡序列H1和H2的自组装。

【技术特征摘要】
1.一种赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：包括赭曲霉毒素的核酸适配体、与该核酸适配体不完全互补的cDNA、两个发卡序列H1和H2；其中，所述赭曲霉毒素的核酸适配体的序列如序列表SEQIDNO.1所示；所述两个发卡序列H1和H2能够自组装成长链；所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA能够触发发卡序列H1和H2的自组装。2.根据权利要求1所述赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA一端具有与发卡序列H1环部序列互补的序列；这段序列通过与发卡序列H1的环部序列互补配对，打开发卡序列H1的茎环结构，以此触发发卡序列H1和H2的自组装。3.根据权利要求2所述赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：所述发卡序列H1的茎部序列与发卡序列H2的环部序列互补，被打开的发卡序列H1通过序列互补打开发卡序列H2的茎环结构；发卡序列H2的茎部序列与发卡序列H1环部序列完全互补或不完全互补；被打开的发卡序列H2通过序列互补进一步打开另一个发卡序列H1的茎环结构；以此完成自组装过程。4.根据权利要求3所述赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：所述发卡序列H1和H2的3’端和5’端分别具有能够形成G-四聚体结构的部分前体核苷酸序列。5.根据权利要求1～4任一项所述赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA与所述赭曲霉毒素核酸适配体之间不互补的碱基个数为3-7个。6.根据权利要求5所述赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA序列如序列表SEQIDNO.2所示。7.根据权利要求1～4任一项所述赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：所述发卡序列H1和H2的序列如序列表SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。8.根据权利要求4所述赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：还...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴薇，杨庆利，于春娣，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37