双受体时间分辨时间分辨荧光共振能量转移法制造技术

本发明专利技术提供了使用双受体时间分辨荧光共振能量转移法确定样品中是否存在多种分析物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供了使用双受体时间分辨荧光共振能量转移法确定样品中是否存在多种分析物的方法。【专利说明】相关申请的交叉引用本申请要求于2012年2月6日提交的第61/595，459号美国申请的权益，这里通过引用将其全部内容并入本文。
本专利技术涉及利用时间分辨突光共振能量转移法(time-resolved fluorescenceresonance energy transfer)确定样品中是否存在两种种或多种分析物的多重分析(multiplex assays)。
技术介绍
时间分辨荧光共振能量转移法(TR-FRET)的应用的基础是供体(donor)分子和受体(acceptor)分子之间的能量传递。FRET是从荧光供体分子至合适的受体分子的非辐射能量的转移。当光源激发供体分子时，就会产生荧光。如果紧邻受体分子且供体分子的发射光谱和受体分子的激发光谱重叠，那么供体分子能够将其激发能量转移至受体分子，而不是发射荧光。之后，受体分析会在受体发射波长下发射荧光。在受体发射波长下出现荧光表明供体和受体分子彼此紧邻，这是因为供体和受体分子需相距小于约20nm，例如相距5?10nm，才能发生能量转移。通常，通过生物亲和性相互作用，例如通过蛋白质-蛋白质结合、抗原-抗体结合、配体-受体结合、DNA杂交和DNA-蛋白质结合，来实现供体和受体分子的接近。 存在种类繁多的供体和受体分子。通常，用于FRET分析中的供体和受体分子是半衰期短的荧光基团。来自样品组分(例如缓冲液、蛋白质、化合物和细胞溶胞产物)的背景荧光能降低常规FRET化学的性能。针对这种会降低分析灵敏度，并且使结果分析复杂化的自发突光(auto-fluorescence),必须对检测到的突光强度进行校正。这种类型的背景突光是瞬时的(具有在纳秒范围内的寿命)，因此可使用时间分辨方法来消除。 TR-FRET利用镧系元素的离子例如铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)、镝(Dy)的离子的特有性质。由于其特定的光物理和光谱性质，稀土离子的络合物对生物学中的荧光应用来说是感兴趣的。具体而言，相对于更常见的荧光基团，它们具有大的斯托克斯位移(Stoke’ sshifts)和长的发射半衰期(从微秒至毫秒)。 通过直接激发难以产生镧系元素离子的荧光，这是因为这些离子吸收光的能力较差。镧系元素必须先与能捕(harvest)光并通过分子内的非辐射过程将光转移至镧系元素的有机部分(organic moieties)络合。稀土元素的螯合物和穴合物是捕光部分(light-harvesting moieties)的实例。所收集的能量被转移至稀土离子,然后发射其特征性的长寿命荧光。镧系元素螯合物通常还具有高量子产率，从而使少量供体产生光亮信号，进而提高了灵敏度。此外，它们的发射峰相当窄，从而对受体发射光的干扰很小。用于技术平台的重要金属之一是铕(在约315?350nm的波长下激发,而在约600?635nm的波长下发射)。
技术实现思路
本专利技术至少部分地基于TR-FRET的新方法。铕的螯合物在至少一个波长下发射能量。在忽略不明显的峰的情况下，其具有两个主要的发射峰:一个峰在约600?635nm处,而另一个在约675?715nm处(图1)。该观测结果增大了存在于TR-FRET分析中的具有两种的受体分子的概率:其中一种与600?635nm的发射峰相互作用，和另一种与675?715nm的发射峰相互作用。因此，镧系元素螯合物受体使得能够进行两个同步的分析以检测样品中的两种分析物或变体(modificat1n)。 一方面，本专利技术提供了确定样品中是否独立存在两种分析物的方法。该方法包括使样品接触第一分析物特异性的结合配体(analyte-specific binding partner)和第二分析物特异性的结合配体，其中该第一和第二分析物特异性的结合配体分别配合(conjugate)至镧系元素螯合物部分(lanthanide chelate moiety);使样品暴露于能够激发第一和第二分析物特异性的结合配体中的螯合物(chelate)的镧系元素的波长范围内的光；以及，独立确定第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体是否分别结合第一分析物和第二分析物，由此确定样品中的这两种分析物是否独立存在。 另一方面，本专利技术特征在于确定酶对两种不同的底物是否具有活性的方法。该方法包括提供包含两种不同底物的样品；在足以从第一底物中产生第一分析物且从第二底物中产生第二分析物的条件下，使该样品和酶接触；使该样品接触第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体，其中第一和第二分析物特异性的结合配体分别配合镧系元素螯合物部分；使样品暴露于能够激发第一和第二分析物特异性的结合配体中螯合物的镧系元素的波长范围内的光；以及，独立地确定第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体是否分别结合第一分析物和第二分析物，由此确定所述酶是否对第一和第二底物具有活性。 又一方面，本专利技术提供了确定两种酶是否独立地对底物具有活性的方法。该方法包括:提供包含底物的样品；在足以用第一酶产生第一分析物和用第二酶产生第二分析物的条件下，使样品接触两种不同的酶；使样品接触第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体，其中第一和第二分析物特异性的结合配体分别配合镧系元素螯合物部分；使样品暴露于能够激发第一和第二分析物特异性的结合配体中的螯合物的镧系元素的波长范围内的光；以及，独立地确定第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体是否分别结合第一分析物和第二分析物，由此独立地确定第一和第二酶对底物的活性。 一方面，本专利技术特征在于确定样品中是否独立存在两种分析物的方法。该方法可以包括使该样品接触结合第一突光能量共振转移(fluorescence energy resonancetransfer) (FRET)受体的第一分析物特异性的结合配体、结合第二 FRET受体的第二分析物特异性的结合配体和包含镧系螯合物部分的化合物；使样品暴露于能够激发螯合物中的镧系元素的波长范围内的光；以及，独立地确定第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体分别结合第一分析物和第二分析物，由此检测样品中是否独立存在这两种分析物。在一些实施方式中，第一和第二分析物分别包含亲和性标记物，而含镧系元素螯合物部分的化合物进一步包括亲和性标记物特异性的结合配体。 又一方面，本文描述了确定两种酶是否独立地对底物具有活性的方法。该方法包括:提供包含底物的样品，其中该底物标记有亲和性标记物；在足以用第一酶产生第一分析物和用第二酶产生第二分析物条件下，使该样品接触两种不同的酶；使该样品接触具有镧系元素螯合物部分的亲和性标记物特异性的结合配体；使该样品接触第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体，其中第一和第二分析物特异性的结合配体分别配合能够由波长为约600?635nm的光激发的检测部分和能够由波长为约675?715nm的光激发的另一检测部分；使该样品暴露于能够激发螯合物中镧系元素的波长范围内的光；以及，独立地确定第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体是否本文档来自技高网...

【技术保护点】
确定样品中是否独立存在两种分析物的方法，其包括：使所述样品接触第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体，其中所述的第一和第二分析物特异性的结合配体分别与镧系元素螯合物部分配合；使所述样品暴露于能够激发所述第一和第二分析物特异性的结合配体中的螯合物的镧系元素的波长范围内的光；和独立确定是否所述第一分析物特异性的结合配体和所述第二分析物特异性的结合配体分别结合所述第一分析物和所述第二分析物，从而确定所述样品中是否独立存在所述两种分析物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P罗比，B伯恩德，S达汉，
申请(专利权)人：珀金埃尔默生物信号股份有限公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA