诱导体细胞重编程的因子以及使用该因子诱导体细胞重编程的方法技术

本发明专利技术提供一种诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子，该因子含有下述基因：Jdp2，Nanog，Essrb，Sall4，Kdm2b，Mkk6和Glis1。本发明专利技术还提供一种诱导体细胞重编程制备多能性干细胞的方法，该方法包括：将上述诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子导入体细胞。进一步地，本发明专利技术提供由上述方法培养得到的多能性干细胞以及该多能性干细胞在药物筛选、器官移植等再生医学方面的应用。

Factor of inducing somatic cell reprogramming and the method of inducing somatic cell reprogramming with this factor

【技术实现步骤摘要】
诱导体细胞重编程的因子以及使用该因子诱导体细胞重编程的方法
本专利技术涉及诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子以及使用该因子诱导体细胞重编程至多能性干细胞的方法。
技术介绍
干细胞是一类能够通过细胞有丝分裂进行自我更新的细胞，并且能够在特定条件下分化为各种特化细胞。干细胞的这种自我更新能力是器官和组织发育所需的细胞分化和特化的基础。最近的证据显示干细胞可用于组织重建并且使生理功能和组织功能恢复。因此，干细胞具有用于治疗多种疾病和损伤(包括神经系统创伤，恶性肿瘤，遗传性疾病，血红蛋白病和免疫缺陷)的潜力。干细胞移植疗法是再生医学研究的一个重要方向，干细胞移植可被用来治疗心脏损伤，神经系统退行性疾病，脊髓损伤，肾衰竭、血液系统疾病等等。然而，干细胞移植疗法面临着异体排斥、细胞来源有限等很多难以解决的问题。诱导多能性干细胞(iPSC，inducedpluripotentstemcell)是一种类似于胚胎干细胞且具有发育全能性的细胞，通过将特定的基因导入体细胞，能够诱导体细胞重编程而获得干细胞特性。2006年，日本京都大学教授Yamanaka(山中伸弥)实验室首次宣布在小鼠的成纤维细胞中导入4个基因(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)成功地将小鼠的成纤维细胞诱导重编程为全能性干细胞，得到的干细胞的性质和胚胎干细胞类似。通过使用经典的Yamanaka因子(即，Oct4，Sox2，Klf4和Myc，也称为OSKM因子)使体细胞重编程至诱导多能性干细胞(iPSC)已在决定细胞命运以及再生医学方面取得了很多有价值的研究结果。目前已报道了不同于OSKM因子的重编程因子，其能够诱导小鼠胚胎成纤维细胞重编程至诱导多能性干细胞，但是其诱导效率低，可重复性低。迄今为止，尚未发现任何与Yamanaka因子具有相同的诱导效率或更好的诱导效率的其他可替代Yamanaka因子的用于诱导体细胞重编程的因子。
技术实现思路
一方面，本专利技术提供一种诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子，该因子包含下述基因：Jdp2，Nanog，Essrb，Sall4，Kdm2b，Mkk6和Glis1。另一方面，本专利技术提供一种诱导体细胞重编程制备多能性干细胞的方法，该方法包括：将上述包含Jdp2，Nanog，Essrb，Sall4，Kdm2b，Mkk6和Glis1的因子导入体细胞。所述导入是通过将上述因子克隆至病毒载体，随后将所述病毒载体转染进病毒包装细胞并由该病毒包装细胞感染所述体细胞而进行的；其中，所述感染进行两次，在首次感染体细胞之后，将感染后的体细胞在含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中进行培养；在二次感染体细胞之后，在iCD1培养基中培养感染后的体细胞，持续使体细胞能够获得多能性的时间段。在一种实施方式中，所述病毒载体是逆转录病毒载体，所述病毒包装细胞是PlatE细胞。在一种实施方式中，所述使体细胞能够获得多能性的时间段为5天至7天。在一种实施方式中，iCD1培养基中补充有5μM的ROCK抑制剂。在本专利技术的方法中，所述体细胞选自：成纤维细胞、尾尖成纤维细胞、骨髓衍生的单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、肝细胞、角质细胞、口腔角质细胞、头发毛囊真皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、滑膜细胞、肾细胞、皮肤上皮细胞、成骨细胞、神经干细胞和真皮细胞。又一方面，本专利技术提供由上述方法培养得到的多能性干细胞。再一方面，本专利技术提供由上述方法培养得到的多能性干细胞在药物筛选、器官移植等再生医学方面的应用。采用本专利技术的诱导体细胞重编程的因子(下文也称为7F因子，即，Jdp2，Nanog，Essrb，Sall4，Kdm2b，Mkk6和Glis1)，通过本专利技术的诱导体细胞重编程制备多能性干细胞的方法，能够诱导体细胞重编程至多能性干细胞，这提供了可替代经典的Yamanaka因子(Oct4，Sox2，Klf4和Myc)的用于诱导体细胞重编程的因子和方法。本专利技术的7F因子对体细胞重编程的诱导效率显著高于经典的Yamanaka因子，并且，由本专利技术的7F因子诱导得到的多能性干细胞的质量远远高于Yamanaka因子。附图说明图1是由本专利技术的7F因子诱导得到多能性干细胞的细胞克隆照片。图2A是由本专利技术的7F因子诱导得到多能性干细胞的细胞形态显微照片。图2B显示了由本专利技术的7F因子诱导得到的多能性干细胞中内源性细胞多能性标志物的表达水平与小鼠成纤维细胞和小鼠胚胎干细胞中内源性细胞多能性标志物的表达水平的比较。图2C显示了由本专利技术的7F因子诱导得到的多能性干细胞中内源性细胞多能性标志物的表达。图2D显示了由本专利技术的7F因子诱导得到的多能性干细胞的核型实验结果。图3显示了由本专利技术的7F因子诱导小鼠尾尖成纤维细胞重编程能够得到多能性干细胞。图4A显示了本专利技术的7F因子诱导得到的多能性干细胞的细胞克隆数与经典的Yamanaka因子诱导得到的多能性干细胞的细胞克隆数的比较。图4B显示了本专利技术的7F因子诱导得到的多能性干细胞的克隆显微照片与经典的Yamanaka因子诱导得到的多能性干细胞的细胞克隆显微照片的比较。图5A显示了多能性干细胞的细胞克隆的三种形态(A型、B型和C型)。图5B显示了分别由本专利技术的7F因子和Yamanaka因子诱导得到的多能性干细胞克隆中A、B和C三种类型的细胞形态所占的比例。图6显示了由本专利技术的7F因子诱导小鼠胚胎成纤维细胞和小鼠尾尖成纤维细胞重编程得到的多能性干细胞的RNA-seq数据分析和由经典的Yamanaka因子诱导小鼠胚胎成纤维细胞得到的多能性干细胞的RNA-seq数据分析。图7显示了将由本专利技术的7F因子诱导得到的多能性干细胞注射到供体小鼠的囊胚腔中，再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中得到的嵌合体小鼠的照片。具体实施方式下文将结合附图以示例性的方式对本专利技术进行详细描述，但是本专利技术并不限于此，本专利技术的范围仅由所附的权利要求限定。诱导体细胞重编程的因子一方面，本专利技术提供能够诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子，该因子包括下述基因：Jdp2，Nanog，Essrb，Sall4，Kdm2b，Mkk6和Glis1；其中，Jdp2的序列如SEQIDNO.1所示，Nanog的序列如SEQIDNO.2所示，Essrb的序列如SEQIDNO.3所示，Sall4的序列如SEQIDNO.4所示，Kdm2b的序列如SEQIDNO.5所示，Mkk6的序列如SEQIDNO.6所示，Glis1的序列如SEQIDNO.7所示。诱导体细胞重编程的方法另一方面，本专利技术提供一种采用上述因子诱导体细胞重编程的方法，其包括将上述诱导体细胞重编程的因子导入体细胞。在本专利技术的方法中，所述导入通常是通过整合病毒载体感染体细胞而进行的。在本专利技术的一些实施方式中，所述导入是通过将本专利技术的诱导体细胞重编程的因子克隆至病毒载体，随后将所述病毒载体转染进病毒包装细胞并由该病毒包装细胞感染所述体细胞而进行的。所述病毒载体可以是逆转录病毒载体、腺病毒载体或慢病毒载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述病毒载体是逆转录病毒。在本专利技术的一种实施方式中，所述病毒包装细胞是PlatE细胞。在本专利技术的一些实施方式中，所述感染进行两次。其中，在首次感染体细胞之后，将感染后的体细胞在含有10％胎牛血清的高糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子，该因子包含下述基因：Jdp2，Nanog，Essrb，Sall4，Kdm2b，Mkk6和Glis1。

【技术特征摘要】
1.一种诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子，该因子包含下述基因：Jdp2，Nanog，Essrb，Sall4，Kdm2b，Mkk6和Glis1。2.权利要求1所述的因子在制备诱导多能性干细胞中的应用。3.一种诱导体细胞重编程制备多能性干细胞的方法，该方法包括：将权利要求1所述的因子导入所述体细胞。4.如权利要求3所述的方法，其中，所述导入是通过将权利要求1所述的因子克隆至病毒载体，随后将所述病毒载体转染进病毒包装细胞并由病毒感染所述体细胞而进行的。5.如权利要求4所述的方法，其中，所述感染进行两次，在首次感染体细胞之后，将感染后的体细胞在含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中进行培养；在二次感染体细胞之后，在iCD1培养基中培养感染后的体细胞，持续使体细胞能够获得多能性的时间段。6.如权利要求4或...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴端卿，刘晶，王波，吴琳琳，刘雨婷，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44