The invention discloses a method for inducing pluripotent stem cells from bovine testicular Sertoli cells, which belongs to the field of stem cells, including the following steps: step 1, isolation of bovine testicular Sertoli cells; step 2, cultivation of bovine testicular Sertoli cells; step 3, transcription factors encoding Oct4, Sox2, c_Myc and Klf4 into bovine testicular Sertoli cells to produce pluripotent stem cells. Compared with the prior art, the invention makes full use of the characteristics of bovine testicular Sertoli cells differentially adhering to the wall, and cultivates uniform bovine testicular Sertoli cells. Because bovine testicular Sertoli cells come from beef calves, they have high reprogramming ability. Using bovine testicular Sertoli cells instead of bovine adult fibroblasts and mesenchymal stem cells as source cells to prepare induced pluripotent stem cells is not only easy to obtain, but also has high reprogramming rate.
【技术实现步骤摘要】
一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法
本专利技术属于干细胞领域,具体地涉及一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法。
技术介绍
胚胎干细胞(EmbryonicStemCells,ESCs)是由内细胞团(Innercellmass,ICM)分离而来的一种具有可分化为三胚层各种类型细胞的多能性干细胞。小鼠、大鼠和人的ESCs的建立、体外培养以及分子方面的研究已经取得了显著进展。但对于大家畜特别是牛ESCs,科研人员在小鼠ESCs的基础上尝试多种体外分离培养的方法,但由于种间差异较大,体外培养基的成分不确定,获取卵细胞来源不便等因素,真正的牛ESCs还未见报道。自1996年7月5日,克隆羊多莉诞生,核移植(somaticcellnucleartransfer,SCNT)技术风靡全球,科学家们发现,这项技术可以将高度分化的体细胞重编程为与ESCs高度相似的多能干细胞。然而,由于核移植对细胞重编程的不确定性,因此即使产生后代也会有畸形,核移植子代寿命会远远短于自然生产的后代等问题,且核移植操作繁琐,周期长,效率低,费时费力。近年来,一类可替代ESCs的细胞问世,诱导多能性干细胞(inducedPluripotentStemCells,iPSCs)是一类与ESCs的形态、生长方式以及生物学特点极其相似的一类多能性细胞。iPSCs技术是将四种特定的转录因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4利用慢病载体导入终末分化的体细胞中,过表达这四种基因后,将体细胞在ESCs的培养条件下获得形态类似ESCs的克隆。目前,已有几篇用牛成纤维细胞(Bovineembryonicfi ...
【技术保护点】
1.一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤1、分离牛睾丸支持细胞:将从屠宰场取回的肉用牛睾丸,在无菌条件下充分分解后加5倍体积DMEM培养基并吹打,吹散成单个曲细精管,静置5min后弃上清,重复5次以去除睾丸间质细胞,至上层液体澄清后加5倍体积的含50μg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ及1mg/mL胶原酶Ⅳ的消化液Ⅰ,32℃恒温摇床孵育60min,转速140rpm;用含10%胎牛血清的DMEM培养基离心洗涤去上清,随后加5倍体积含1mg/mL胰蛋白酶、1mg/mL透明质酸酶、50μg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、1mg/mL胶原酶IV的消化液Ⅱ,32℃恒温摇床孵育30min,用含有10%胎牛血清的DMEM培养基离心洗涤后加DMEM培养基重悬;用40μm细胞过滤网进行过滤,收集滤液并离心洗涤,弃上清后以1mL的DMEM培养基重悬,2h后,牛睾丸支持细胞进行差异贴壁,得到牛睾丸支持细胞;步骤2、培养牛睾丸支持细胞;步骤3、将编码Oct4、Sox2、c‑Myc和Klf4四种转录因子转入牛睾丸支持细胞中,产生多能性干细胞。
【技术特征摘要】
1.一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤1、分离牛睾丸支持细胞:将从屠宰场取回的肉用牛睾丸,在无菌条件下充分分解后加5倍体积DMEM培养基并吹打,吹散成单个曲细精管,静置5min后弃上清,重复5次以去除睾丸间质细胞,至上层液体澄清后加5倍体积的含50μg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ及1mg/mL胶原酶Ⅳ的消化液Ⅰ,32℃恒温摇床孵育60min,转速140rpm;用含10%胎牛血清的DMEM培养基离心洗涤去上清,随后加5倍体积含1mg/mL胰蛋白酶、1mg/mL透明质酸酶、50μg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、1mg/mL胶原酶IV的消化液Ⅱ,32℃恒温摇床孵育30min,用含有10%胎牛血清的DMEM培养基离心洗涤后加DMEM培养基重悬;用40μm细胞过滤网进行过滤,收集滤液并离心洗涤,弃上清后以1mL的DMEM培养基重悬,2h后,牛睾丸支持细胞进行差异贴壁,得到牛睾丸支持细胞;步骤2...
【专利技术属性】
技术研发人员:张学明,姜禹,李子义,安星兰,蔡宁宁,张胜,赵欣欣,朱文倩,唐博,
申请(专利权)人:吉林大学,
类型:发明
国别省市:吉林,22
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