线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用技术

本发明专利技术属于医疗技术技术领域，尤其为线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，其特征在于：包括以下步骤：S1:干细胞提取；S2:干细胞培养；S3:干细胞实验；本发明专利技术的优点在于它可以无创获取，并且无论患者的性别，年龄和健康状况都可以获取。而且它作为原代细胞，保有原有细胞的基本性质，从突变患者的尿液中分离提取出干细胞，通过细胞单克隆分离出无突变的尿液干细胞，具有分化为无突变的正常成骨细胞和正常脂肪细胞的潜能，为患者进行自体干细胞治疗提供了理论依据和技术支持。

【技术实现步骤摘要】
线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用
本专利技术属于医疗
，具体涉及线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用。
技术介绍
干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”，间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，自体尿液来源的干细胞是一种新型的间充质干细胞，具有取材容易，无创，供应充足可反复取材，且没有伦理上的争议。线粒体基因tRNALeu(UUR)A3243G突变(以下简称tRNALeu(UUR)A3243G突变)糖尿病是一种以糖尿病伴神经性耳聋为主要临床表现的母系遗传单基因突变糖尿病，该疾病是由于编码线粒体亮氨酸tRNA基因——tRNALeu(UUR)发生突变、即线粒体DNA第3243位核苷酸序位发生A→G突变所致，tRNALeu(UUR)A3243G突变容易累及ATP阈值高的组织，主要临床特点表现为：40岁以前起病的早发糖尿病，患者多消瘦，病程中胰岛功能进行性衰退，糖尿病确诊后2年内常需改用胰岛素治疗，其病理生理机制是胰岛β细胞线粒体功能损害致胰岛素分泌不足，超过75％患者有感觉神经性耳聋，亦可伴有神经系统、眼、骨骼肌、心脏及肾脏等病变，且病变呈母系遗传，患者的外周血和尿液具有杂胞质性的特征，即突变细胞和正常细胞在不同组织中共同存在且比例不同。尿液源的干细胞也存在这个问题，目前人工修饰线粒体tRNALeu(UUR)A3243G仍然十分困难，还没有很好的手段对突变基因进行编辑，因此如何从突变患者中分离出正常的尿液间充质干细胞是目前该类患者的难题，也是未来治疗的方向。在有线粒体DNA突变的组织细胞内，有的线粒体环内含突变型基因，有的线粒体环内含野生型基因。这两种线粒体环在组织细胞内混杂存在，即为杂胞质性。同一种组织细胞之间的杂胞质程度可不一致，即细胞之间含突变型线粒体环的数量比例可不一致。此见于一个个体的各个卵细胞之间，亦见于受精卵分化发育成的各种组织细胞间，因此，同一种基因突变在不同个体中就可因这种组织细胞杂胞质性，致不同组织细胞的突变线粒体负荷有很大差异，以致个体间可能呈现迥然相异的临床表现。在患者的尿液干中同样存在这个问题，因此如何用患者自身的尿液干细胞进行治疗有很大的困难。
技术实现思路
为解决上述
技术介绍
中提出的问题。本专利技术提供了线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，具有无创获取和不限制患者性别、年龄和健康状况的特点。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，其特征在于：包括以下步骤：S1:干细胞提取；S2:干细胞培养；S3:干细胞实验。优选的，所述S1步骤是指将三抗加入T75瓶中，并将T75瓶子喷上消毒水，进行尿液采集，然后从200ml患者尿液中提取出尿液干细胞，并采用0.1-1％明胶包被过的96孔培养板进行培养，明胶包被96孔板，放入孵箱。优选的，所述S2步骤是指将尿液转移到4支50ml离心管内，密封后，离心样本，转速为1500/10min,离心完成后，将细胞转移到15ml～20mlPBS内，吹打混匀，再次离心，转速为1500/10min。尿液干细胞培养基重悬细胞，接种至96孔板进行培养，第3天或第4天半量加液，第5或第6天半量换液，第10天左右将出现成单克隆集簇的细胞团，当细胞密集程度达80％～90％时进行消化传代，传代为P1代，后续细胞培养每2～3天换液，待细胞达80％～90％融合时进行正常传代。焦磷酸测序：96孔板，每孔各加70uLbindingbuffermix,各孔对应PCR产物10uL，振荡器打开，25℃，1300rpm震荡15Min，加入引物和缓冲液，24孔圆板置于振荡器，80℃，5min，0rpm。记录A>G的突变率。非突变的尿液干细胞用于后续。成骨分化：将细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，当细胞融合度达到60％-70％时，小心的将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2mL成人骨髓间质干细胞成骨诱导分化完全培养基(Cyagen,HUXMA-90021)，每2～3天换用新鲜的成人骨髓间质干细胞成骨诱导分化完全培养基(使用前需预热至37℃),诱导2-4周后，视细胞的形态变化及生长情况，用茜素红进行染色并进行相关实验。成脂分化：将细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，当细胞融合度达到100％或者过融合，小心地将间质干细胞完全培养基吸走，向六孔板中加入2mL成人骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基(Cyagen,HUXMA-90031)A液，诱导3天后，吸走六孔板中的A液，加入2mL成人骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基B液，24h后，吸走B液，换回A液进行诱导，A液和B液交替作用3-5次后(交替次数视分化情况而定)，继续用B液维持培养4-7天直到脂滴变得足够大、圆，B液维持培养期间，每隔2-3天需要换用新鲜的B液。优选的，所述S3步骤是指根据S2步骤的干细胞培养情况，视细胞的形态变化及分化情况，进行线粒体功能检测、分化能力等相关实验。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术，的优点在于它可以无创获取并且无论患者的性别，年龄和健康状况都可以获取。而且它作为原代细胞，保有原有细胞的基本性质，从突变患者的尿液中分离提取出干细胞，通过细胞单克隆分离出无突变的尿液干细胞，继而分化为无突变的成骨细胞，对未来对患者进行自体干细胞治疗提供了理论依据和技术支持。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为本专利技术尿液干细胞培养过程变化示意图；图2为本专利技术间充质干细胞各种标记物检测，证实分离出的确实为间充质干细胞的示意图；图3为本专利技术成骨分化第14天和第18天，光镜下ALP染色显示突变病人非突变干细胞的成骨分化和正常人的ALP差异对比的示意图；图4为本专利技术成脂肪分化时的证实突变患者非突变干细胞和正常干细胞一样可以分化为脂肪细胞的示意图；图5为本专利技术焦磷酸测序记录时的记录A>G的突变率结果的示意图；图6为本专利技术膜电位检测时记录突变携带者无突变的干细胞和正常人的干细胞ATP、ROS和膜电位差异的示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1尿液干细胞突变率检测；1、从突变患者的尿液中分离培养干细胞并单克隆分离培养；2、抽提细胞DNA并对样本DNA做浓度测定；3、对抽提到的DNA进行PCR扩增；4、焦磷酸测序，96孔板，每孔各加70uLbindingbuffermix,各孔对应PCR产物10uL，振荡器打开，25℃，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，其特征在于：包括以下步骤：S1:干细胞提取；S2:干细胞培养；S3:干细胞实验。

【技术特征摘要】
1.线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，其特征在于：包括以下步骤：S1:干细胞提取；S2:干细胞培养；S3:干细胞实验。2.根据权利要求1所述的线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，其特征在于：所述S1步骤是指将三抗加入T75瓶中，并将T75瓶子喷上消毒水，进行尿液采集，然后从200ml患者尿液中提取出尿液干细胞，并采用0.1-1％明胶包被过的96孔培养板进行培养，明胶包被96孔板，放入孵箱。3.根据权利要求1所述的线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，其特征在于：所述S2步骤是指将尿液转移到4支50ml离心管内，密封后，离心样本，转速为1500/10min,离心完成后，将细胞转移到15ml～20mlPBS内，吹打混匀，再次离心，转速为1500/10min。尿液干细胞培养基重悬细胞，接种至96孔板进行培养，第3天或第4天半量加液，第5或第6天半量换液，第10天左右将出现成单克隆集簇的细胞团，当细胞密集程度达80％～90％时进行消化传代，传代为P1代，后续细胞培养每2～3天换液，待细胞达80％～90％融合时进行正常传代。焦磷酸测序：96孔板，每孔各加70uLbindingbuffermix,各孔对应PCR产物10uL，振荡器打开，25℃，1300rpm震荡15Min，加入引...

【专利技术属性】
技术研发人员：王从容，张宜男，陆惠娟，姜之歆，贾伟平，
申请(专利权)人：上海市第六人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31