培养人类角膜缘干细胞的方法技术

本发明专利技术揭露一种培养人类角膜缘干细胞的方法，其步骤包含：预处理一滋养细胞；将滋养细胞接种于一多孔膜；将多孔膜置入一容器中，使容器分隔为第一培养室以及第二培养室，其中，滋养细胞位于第二培养室；于容器中注入培养基；以及将人类角膜缘干细胞置于第一培养室。相较于习知技术，本发明专利技术培养人类角膜缘干细胞的方法利用多孔膜的培养技术培养人类角膜缘干细胞，使人类角膜缘干细胞的扩大率更优于传统培养方式。此外，本发明专利技术所使用的培养基不含有具毒性的二甲基亚砜成分，以降低细胞受毒杀的机率。

Method of culturing human limbal stem cells

The invention discloses a method for culturing human limbal stem cells, which comprises the following steps: pretreatment of a trophoblast; inoculation of a trophoblast into a porous membrane; placement of a porous membrane in a container to separate the container into a first culture chamber and a second culture chamber, in which the trophoblast is located in a second culture chamber; injection of a culture medium into the container; and placement of human limbal stem cells. In the first incubator. Compared with learning technology, the method of cultivating human limbal stem cells by the present invention utilizes porous membrane culture technology to cultivate human limbal stem cells, so that the expansion rate of human limbal stem cells is better than the traditional culture method. In addition, the culture medium used in the present invention does not contain toxic dimethyl sulfoxide ingredients, so as to reduce the probability of cell poisoning.

【技术实现步骤摘要】
培养人类角膜缘干细胞的方法
本专利技术关于一种培养人类角膜缘干细胞的方法，并且特别地，关于一种利用多孔膜培养人类角膜缘干细胞的方法。
技术介绍
角膜表面的正常与稳定对于保持角膜透明和维持正常的生理功能极为重要，不仅是角膜和结膜之间的堤坝，更是角膜上皮再生的来源。角膜的缺陷主要是由创伤、细菌感染、化学性灼伤与隐形眼镜造成。据统计显示，全球约有1300万人患有影响视力的角膜损伤或疾病，并且每年亦诊断1500至200万件新发病例。角膜的缺陷可能导致一系列眼睛疾病，甚至会导致失明。角膜缘干细胞(LimbalStemCells,LSCs)的发现是近几十年来眼科学最重要的进展之一。就目前而言，角膜缘干细胞的移植手术是治疗眼表疾病以及重建角膜结构最有效的治疗方式。体外培养角膜缘干细胞培养的标准方法是直接将角膜缘干细胞放置在停滞生长的滋养细胞(Feedercell)上共同培养。于培养其间，滋养细胞会分泌细胞激素以提供角膜缘干细胞的扩增。然而，角膜缘干细胞随着细胞的扩增形成群落，而将滋养细胞推开，这可能会导致滋养细胞的供应不足。此外，由于培养过程中角膜缘干细胞直接接触滋养细胞，因此在收成角膜缘干细胞的过程中很难将滋养细胞完全清除，造成交叉污染的风险。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种培养人类角膜缘干细胞的方法，其步骤包含：将一滋养细胞与一丝裂霉素C(MitomycinC)于定温下进行一反应处理，其中丝裂霉素C的浓度范围介于1至25μg/mL之间，反应处理的时间介于2小时至2小时45分钟之间，之后再将丝裂霉素C予以去除；将处理完成的滋养细胞混合一次培养基，并且接种于一多孔膜；将接种有滋养细胞的多孔膜设置于一容器中，以使容器被分隔成一第一培养室以及一第二培养室，其中滋养细胞位于第二培养室；于容器中注入一主培养基以充满第一培养室以及第二培养室；以及，将一人类角膜缘干细胞设置于第一培养室进行细胞培养。于一具体实施例中，丝裂霉素C浓度为5μg/mL，且该滋养细胞与该丝裂霉素C的该反应处理的时间为2小时15分钟。于一具体实施例中，多孔膜由聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethyleneterephthalate,PET)材质所构成，且孔径大小为0.4μm。多孔膜允许滋养细胞所释放的细胞激素通过，以滋养人类角膜干细胞扩大，并且同时防止滋养细胞与人类角膜干细胞接触。于一具体实施例中，主培养基和次培养基为相同成分的培养基，且培养基的基底为达尔伯克氏基础培养基12型(Dulbecco'sMinimumEssentialMedium/F12,DMEM/F12)。培养基添加成分包含左旋谷氨酰胺(L-Glutamine)、三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine)、胰岛素(Insulin)、转铁蛋白(Transferrin)以及亚硒酸(Selenousacid)，并且二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)含量低于0.1％。于实际应用上，滋养细胞为小鼠纤维母细胞(Swiss-3T3fibroblast)。相较于习知技术，本专利技术培养人类角膜缘干细胞的方法运用一种独特培养基以及培养参数配合多孔膜的培养技术培养人类角膜缘干细胞，使人类角膜缘干细胞的扩大率更优于传统培养方式。此外，本专利技术所使用的培养基不含有具毒性的二甲基亚砜成分，使细胞受到毒杀的机率降低。附图说明图1为本专利技术的培养人类角膜缘干细胞的方法的一具体实施例的步骤流程图。图2为预处理滋养细胞步骤的一具体实施例的进阶流程图。图3为本专利技术的培养人类角膜缘干细胞的方法的一具体实施例的进阶流程图。图4为预处理滋养细胞步骤的一具体实施例的示意图。图5为接种滋养细胞步骤的一具体实施例的示意图。图6为多孔膜置入容器步骤的一具体实施例的示意图。图7为注入培养基步骤的一具体实施例的示意图。图8为放置人类角膜缘干细胞步骤的一具体实施例的示意图。图9为一具体实施例的传统培养人类角膜缘干细胞方式的步骤流程图。图10为一具体实施例的传统培养人类角膜缘干细胞方式的示意图。图11(A)为实验1的二维位图。图11(B)为实验2的二维位图。图12为实验1与实验2的人类角膜缘干细胞扩大率。图13(A)为实验1的细胞群落图。图13(B)为实验2的细胞群落图。图14为实验1与实验2的细胞群落分析图。图15为实验1与实验2的群落尺寸分析图。其中，附图标记说明如下：S1：步骤S2：步骤S2-2：步骤S3：步骤S4：步骤S5：步骤S6：步骤S7：步骤S12：步骤S14：步骤S16：步骤100：滋养细胞110：细胞培养瓶120：小鼠纤维母细胞培养基200：人类角膜缘干细胞220：人类角膜缘干细胞培养基300：多孔膜310：底面400：容器410：第一培养室420：第二培养室具体实施方式为了让本专利技术的优点，精神与特征可以更容易且明确地了解，后续将以具体实施例并参照所附附图进行详述与讨论。值得注意的是，这些具体实施例仅为本专利技术代表性的具体实施例，其中所举例的特定方法、装置、条件、材质等并非用以限定本专利技术或对应的具体实施例。又，图中各装置仅用于表达其相对位置且未按其实际比例绘述，合先叙明。请参考图1，图1为本专利技术的培养人类角膜缘干细胞的方法的一具体实施例的步骤流程图。本专利技术提供一种培养人类角膜缘干细胞的方法，其步骤包含：S1：预处理一滋养细胞；S2：接种滋养细胞于一多孔膜；S3：将多孔膜设置于一容器中；S4：于容器中注入一培养基；以及S5：将一人类角膜缘干细胞设置于容器中进行细胞培养。请参考图2，图2为预处理滋养细胞步骤的一具体实施例的进阶流程图。于本专利技术的一具体实施例中，预处理滋养细胞S1的步骤又进一步包含以下步骤：S12：在滋养细胞中添加包含有丝裂霉素C的培养基；S14：于培养箱中进行反应；S16：去除包含有丝裂霉素C的培养基。请参考图3，图3为本专利技术的培养人类角膜缘干细胞的方法的一具体实施例的进阶流程图。于步骤S5后约经过3至5天，执行步骤S6：抽除培养基；以及步骤S7：细胞继代。以下将以附图说明步骤S1-S5的操作流程。请参考图1、图2以及图4，图4为预处理滋养细胞步骤S1的一具体实施例的示意图。于一具体实施例中，本专利技术使用小鼠纤维母细胞(Swiss-3T3fibroblast)作为滋养细胞100，并且将滋养细胞100放入细胞培养瓶(T75Flask)110中。在细胞培养瓶110中注入添加有浓度1至25μg/mL丝裂霉素C(MitomycinC)的小鼠纤维母细胞培养基120，其中，丝裂霉素C较佳的添加浓度为5μg/mL。之后，将细胞培养瓶110放入37℃定温的培养箱中反应2小时至2小时45分钟，其中，较佳的反应时间为2小时15分钟。反应完成后，抽出细胞培养瓶110中的小鼠纤维母细胞培养基120(含有丝裂霉素C)，并且以1倍的磷酸盐缓冲溶液(1×PBS)清洗滋养细胞100。将清洗完成的滋养细胞100放入离心机中以300g离心3分钟，以完成滋养细胞100的预处理流程。此预处理步骤S1目的在于抑制滋养细胞100的分裂扩大同时又保有正常细胞生理代谢，使滋养细胞100与人类角膜缘干细胞共同培养的过程中，滋养细胞100能正常提供细胞激素给人类角膜干细胞，又不至于抢夺培养基中的养分。请参考图1以及图5，图5为接种滋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养人类角膜缘干细胞的方法，其步骤包含：将一滋养细胞与一丝裂霉素C(Mitomycin C)于定温下进行一反应处理，其中该丝裂霉素C的浓度范围介于1至25μg/mL之间，该反应处理的时间介于2小时至2小时45分钟之间，之后再将该丝裂霉素C予以去除；将处理完成的该滋养细胞混合一次培养基，并且接种于一多孔膜；将接种有该滋养细胞的该多孔膜设置于一容器中，以使该容器被分隔成一第一培养室以及一第二培养室，其中该滋养细胞位于该第二培养室；于该容器中注入一主培养基以充满该第一培养室以及该第二培养室；以及将一人类角膜缘干细胞设置于该第一培养室。

【技术特征摘要】
1.一种培养人类角膜缘干细胞的方法，其步骤包含：将一滋养细胞与一丝裂霉素C(MitomycinC)于定温下进行一反应处理，其中该丝裂霉素C的浓度范围介于1至25μg/mL之间，该反应处理的时间介于2小时至2小时45分钟之间，之后再将该丝裂霉素C予以去除；将处理完成的该滋养细胞混合一次培养基，并且接种于一多孔膜；将接种有该滋养细胞的该多孔膜设置于一容器中，以使该容器被分隔成一第一培养室以及一第二培养室，其中该滋养细胞位于该第二培养室；于该容器中注入一主培养基以充满该第一培养室以及该第二培养室；以及将一人类角膜缘干细胞设置于该第一培养室。2.如权利要求1所述的方法，其中该丝裂霉素C浓度为5μg/mL，且该滋养细胞与该丝裂霉素C的该反应处理的时间为2小时15分钟。3.如权利要求1所述的方法，其中该滋养细胞于该培养基中释放一细胞激素，该多孔膜允许该细胞激素传递于该第一培养室以及该第二培养室之间，并且防止该滋养细胞以及该人类角膜缘干细胞传递。4.如权利要求1所述的方法，其中该多孔膜由聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethyleneterephthalate,PET)材质所构成，且该多孔膜的孔径大小为0.4μm。5.如权利要求1所述的方法，其中该主培养基以及该次培养基为相同...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧耿良，
申请(专利权)人：三鼎生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71