一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞的诱导分化方法，特别涉及一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的培养方法，将单核细胞培养在培养液中，待细胞达80％‑90％融合后，消化处理，沉淀物再加入培养液传代培养；再依次第一诱导培养液、第二诱导培养液诱导培养，换成培养液培养。本发明专利技术可以提高单核细胞向多潜能胚胎干细胞株分化，该成熟的细胞表现为多种标志蛋白的表达，使单核细胞能很好地运用到后续的实验中，为临床上更合理的将单核细胞用于治疗提供了实验数据和理论依据。

【技术实现步骤摘要】
一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的培养方法
本专利技术涉及细胞的诱导分化方法，特别涉及一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的培养方法。
技术介绍
目前已经研究发现，在包括血管内皮生长因子在内的多种因子诱导下，单核细胞能够转化成血管内皮细胞，比如采用Ficoll密度梯度离心法分离成人新鲜外周血单核细胞，用细胞培养基培养，然后分别用纤维连接蛋白、肿瘤坏死因子α诱导24h。用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测单核细胞对淋巴管内皮特异性标志物LYVE-1、Podoplanin、Prox1、血管内皮生长因子受体3以及内皮细胞抗原vWF、内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子受体2的基因和蛋白表达。但是目前的单核细胞向多潜能细胞转化率较低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的培养方法，通过该方法，将单核细胞诱导分化为成熟多潜能细胞。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的培养方法，包括以下步骤：(1)将单核细胞培养在培养液中，放入培养箱中，待细胞达80％-90％融合后，洗弃未贴壁的细胞；加入质量浓度0-25％胰蛋白酶进行消化处理直到细胞收缩呈圆形，加入培养液终止消化反应，采用离心分离3-5分钟，然后沉淀弃去上清液，沉淀物再加入培养液，吸管轻轻吹打细胞制成悬液；按1∶4比例传代培养到培养板上，置于培养箱中培养，每2-4天更换一次培养液；所述的培养箱的条件均为37℃、体积分数5％CO2。所述的培养液为KSFM培养液，并且加入体积百分比为10％的胎牛血清。(2)待步骤(1)中的培养板上的细胞长满后置于第一诱导培养液中进行诱导培养，两天将第一诱导培养液更换成第二诱导培养液，在诱导培养两天，然后将第二诱导培养液更换成培养液，将诱导好的细胞接种转移至含有培养液的6孔板中培养，初次传代时间为6-8天，细胞生长至90％融合，按照1∶4的比例转移转移至9cm平皿中进行传代培养，3-4天传代一次，连续传代5-7代后，每2-4天更换一次培养液，获得状态良好的细胞，即为多潜能干细胞。所述的培养液为KSFM培养液，并且加入体积百分比为10％的胎牛血清。其中，所述的第一诱导培养液，以含有体积百分比为10％胎牛血清的KSFM培养液为基础培养液，还包括有0.2-0.5mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、3-5mmol/L地塞米松、120-350nmol/L胰岛素、0.5-1.2nmol/L三碘甲状腺原氨酸、0.1-0.25mmol/L吲哚美辛，1-2μmol/L罗格列酮；还含有50-100U/ml青霉素和50-100μg/ml链霉素。所述的第二诱导培养液，以含有体积百分比为5％胎牛血清的KSFM培养液为基础培养液，还包括6-10μg/ml胰岛素，1-2nmol/L三碘甲状腺氨酸，1-2μmol/L罗格列酮；更优选地，还含有2-5μmol/LS-腺苷高半胱氨酸水解酶，10-30μg/ml维生素C，这是本专利技术的专利技术人发现会有在培养过程中杂菌产生的问题，在抑制杂菌生长的问题上专利技术人经过了多次试验，后来发现使用具有广谱抗病毒活性的腺苷衍生物的作用靶，尤其是抗出血热病毒抑制剂的目的靶的S-腺苷高半胱氨酸水解酶具有最好的效果，同时，进一步添加维生素C可以保持细胞的活性。本专利技术具有以下优点：本专利技术可以提高单核细胞向多潜能胚胎干细胞株分化，该成熟的细胞表现为多种标志蛋白的表达，使单核细胞能很好地运用到后续的实验中，为临床上更合理的将单核细胞用于治疗提供了实验数据和理论依据。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术作进一步说明，用成人新鲜外周血单核细胞进行诱导培养。实施例1(1)将单核细胞培养在培养液中，放入培养箱中，待细胞达80％-90％融合后，洗弃未贴壁的细胞；加入质量浓度0.25％胰蛋白酶进行消化处理直到细胞收缩呈圆形，加入培养液终止消化反应，采用离心分离3-5分钟，然后沉淀弃去上清液，沉淀物再加入培养液，吸管轻轻吹打细胞制成悬液；按1∶4比例传代培养到培养板上，置于培养箱中培养，每2-4天更换一次培养液；所述的培养箱的条件均为37℃、体积分数5％CO2。所述的培养液为KSFM培养液，并且加入体积百分比为10％的胎牛血清。(2)待步骤(1)中的培养板上的细胞长满后置于第一诱导培养液中进行诱导培养，两天将第一诱导培养液更换成第二诱导培养液，在诱导培养两天，然后将第二诱导培养液更换成培养液，将诱导好的细胞接种转移至含有培养液的6孔板中培养，初次传代时间为6-8天，细胞生长至90％融合，按照1∶4的比例转移转移至9cm平皿中进行传代培养，3-4天传代一次，连续传代5-7代后，每2-4天更换一次培养液，获得状态良好的细胞，即为多潜能干细胞。所述的培养液为KSFM培养液，并且加入体积百分比为10％的胎牛血清。所述的第一诱导培养液，以含有体积百分比为10％胎牛血清的KSFM培养液为基础培养液，还包括有0.2mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、4mmol/L地塞米松、300nmol/L胰岛素、0.8nmol/L三碘甲状腺原氨酸、0.1mmol/L吲哚美辛，2μmol/L罗格列酮。所述的第二诱导培养液，以含有体积百分比为5％胎牛血清的KSFM培养液为基础培养液，还包括6μg/ml胰岛素，1nmol/L三碘甲状腺氨酸，2μmol/L罗格列酮；还含有5μmol/LS-腺苷高半胱氨酸水解酶，18μg/ml维生素C。实施例2(1)将单核细胞培养在培养液中，放入培养箱中，待细胞达80％-90％融合后，洗弃未贴壁的细胞；加入质量浓度0.25％胰蛋白酶进行消化处理直到细胞收缩呈圆形，加入培养液终止消化反应，采用离心分离3-5分钟，然后沉淀弃去上清液，沉淀物再加入培养液，吸管轻轻吹打细胞制成悬液；按1∶4比例传代培养到培养板上，置于培养箱中培养，每2-4天更换一次培养液；所述的培养箱的条件均为37℃、体积分数5％CO2。所述的培养液为KSFM培养液，并且加入体积百分比为10％的胎牛血清。(2)诱导分化待步骤(1)中的培养板上的细胞长满后置于第一诱导培养液中进行诱导培养，两天将第一诱导培养液更换成第二诱导培养液，在诱导培养两天，然后将第二诱导培养液更换成培养液，将诱导好的细胞接种转移至含有培养液的6孔板中培养，初次传代时间为6-8天，细胞生长至90％融合，按照1∶4的比例转移转移至9cm平皿中进行传代培养，3-4天传代一次，连续传代5-7代后，每2-4天更换一次培养液，获得状态良好的细胞，即为多潜能干细胞。所述的培养液为KSFM培养液，并且加入体积百分比为10％的胎牛血清。所述的第一诱导培养液，以含有体积百分比为10％胎牛血清的KSFM培养液为基础培养液，还包括有0.5mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、3mmol/L地塞米松、150nmol/L胰岛素、0.5nmol/L三碘甲状腺原氨酸、0.2mmol/L吲哚美辛，2μmol/L罗格列酮；还含有100U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。所述的第二诱导培养液，以含有体积百分比为5％胎牛血清的KSFM培养液为基础培养液，还包括6-10μg/ml胰岛素，1nmol/L三碘甲状腺氨酸，2μmol/L罗格列酮。对诱导培养结果进行检测分析，单核细胞在诱导之前，对LYVE-1表达阳性；对Podoplanin本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将单核细胞培养在培养液中，放入培养箱中，待细胞达80％‑90％融合后，洗弃未贴壁的细胞；加入质量浓度0.25％胰蛋白酶进行消化处理直到细胞收缩呈圆形，加入培养液终止消化反应，采用离心分离3‑5分钟，然后沉淀弃去上清液，沉淀物再加入培养液，吸管轻轻吹打细胞制成悬液；按1∶4比例传代培养到培养板上，置于培养箱中培养，每2‑4天更换一次培养液；(2)待步骤(1)中的培养板上的细胞长满后置于第一诱导培养液中进行诱导培养，两天将第一诱导培养液更换成第二诱导培养液，在诱导培养两天，然后将第二诱导培养液更换成培养液，诱导好的细胞在培养中继续培养，每2‑4天更换一次培养液。

【技术特征摘要】
1.一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将单核细胞培养在培养液中，放入培养箱中，待细胞达80％-90％融合后，洗弃未贴壁的细胞；加入质量浓度0.25％胰蛋白酶进行消化处理直到细胞收缩呈圆形，加入培养液终止消化反应，采用离心分离3-5分钟，然后沉淀弃去上清液，沉淀物再加入培养液，吸管轻轻吹打细胞制成悬液；按1∶4比例传代培养到培养板上，置于培养箱中培养，每2-4天更换一次培养液；(2)待步骤(1)中的培养板上的细胞长满后置于第一诱导培养液中进行诱导培养，两天将第一诱导培养液更换成第二诱导培养液，在诱导培养两天，然后将第二诱导培养液更换成培养液，诱导好的细胞在培养中继续培养，每2-4天更换一次培养液。2.根据权利要求1所述的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的培养方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述的培养液为KSFM培养液，并且加入体积百分比为10％的胎牛血清。3.根据权利要求1所述的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的培养方法，其特征在于：步骤(1)中所述的培养箱的条件均为37℃、体积分数5％CO2。4.根据权利要求1所述的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的培养方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的第一诱导培养液，以含有体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：马亚东，黄宗堂，曹娜，
申请(专利权)人：丰泽康生物医药深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44