一种脐带间充质干细胞活性物与脐带血干细胞活性物的复合物的制备方法技术

本发明专利技术涉及干细胞制剂技术领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞活性物与脐带血干细胞活性物的复合物的制备方法，提取脐带组织得到原代脐带干细胞；培育第五代原代脐带间充质干细胞，并获得细胞培养上清液进行离心，并对所述上清溶液进行过滤、超滤浓缩，加入冻干保护剂，并进行真空冷冻干燥，得到脐带间充质干细胞活性物冻干粉末；获得脐带血，进行传代培养；分离得到脐带血干细胞溶液，反复冻融至细胞完全破碎，得到脐带血干细胞提取物溶液，冻干制得脐带血干细胞活性物冻干粉。本发明专利技术所得的制剂具有更好促进皮肤烫伤修复的作用，能促进皮肤烫伤的创面愈合、更好地促进其表皮的再生化、皮肤细胞增殖再生能力等作用。

A preparation method of complex of cord blood stem cell activity and cord mesenchymal stem cell activity

The invention relates to the technical field of stem cell preparation, in particular to a preparation method of the compound of the active substance of umbilical cord mesenchymal stem cells and the active substance of umbilical cord blood stem cells, extracting the umbilical cord tissue to obtain the primary umbilical cord stem cells, cultivating the fifth primary umbilical cord mesenchymal stem cells, obtaining the cell culture supernatant for centrifugation, filtering and ultrafiltration concentration of the supernatant solution , add freeze-drying protective agent and freeze-drying in vacuum to obtain the freeze-dried powder of cord blood mesenchymal stem cell active substance; obtain cord blood for subculture; separate and obtain cord blood stem cell solution, freeze-thaw repeatedly until the cell is completely broken, obtain cord blood stem cell extract solution, freeze-dried to obtain cord blood stem cell active substance freeze-dried powder. The preparation has the functions of better promoting the repair of skin scald, promoting the wound healing of skin scald, better promoting the regeneration of its epidermis, the proliferation and regeneration ability of skin cells, etc.

【技术实现步骤摘要】
一种脐带间充质干细胞活性物与脐带血干细胞活性物的复合物的制备方法
本专利技术涉及干细胞制剂
，特别涉及一种脐带间充质干细胞活性物与脐带血干细胞活性物的复合物的制备方法。
技术介绍
间充质干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，存在于骨髓、脂肪组织、脐血及多种胎儿组织。它可分泌多种细胞因子及生长因子，促进造血干细胞的增殖与分化。还具有免疫调节、抗炎和组织修复作用，可减轻移植物抗宿主病及其他移植相关并发症。间充质干细胞目前主要是从脊髓和脐血中提取的。脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。人体脐带血间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。皮肤损伤是日常生活常见的一种创伤。目前大面积的皮肤损伤治疗主要通过全身支持治疗、创面的清理及结痂切除和外科植皮等方法，传统的治疗方法虽然有一定效果但其结痂深度难于把握、皮源紧张和易感染的问题有待解决。近年来，以干细胞特别是间质干细胞为基础的皮肤再生医学研究得到广泛关注，目前提高细胞干性和促再生能力的主要是通过基因改造的方法，但是基因编辑的不确定性导致其改造后的干细胞具有安全性的问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种脐带间充质干细胞活性物与脐带血干细胞活性物的复合物的制备方法，目的在于克服现有技术中存在干细胞使用安全的缺陷。为解决上述的技术问题，具体技术方案：一种脐带间充质干细胞活性物与脐带血干细胞活性物的复合物的制备方法，包括以下步骤：(1)获得脐带间充质干细胞活性物；(1.1)提取脐带组织；(1.2)利用所述脐带组织制备原代脐带干细胞；(1.3)利用所述原代脐带干细胞培育第五代原代脐带间充质干细胞，并获得细胞培养上清液；(1.4)将所述细胞培养上清液进行离心，收集上清溶液，并对所述上清溶液进行过滤；然后进行超滤浓缩；(1.5)超滤浓缩后加入冻干保护剂，并进行真空冷冻干燥，得到脐带间充质干细胞活性物冻干粉末；(2)获得脐带血干细胞活性物；(2.1)获得脐带血，放入培养箱中，恒温恒湿持续进行传代培养；(2.2)弃去培养基，分离得到脐带血干细胞溶液；(2.3)将脐带血干细胞溶液冻结，然后在4～8℃的温度下解冻，如此反复冻融至细胞完全破碎，采用孔径为0.22μm的过滤膜过滤，除去杂质，得到脐带血干细胞提取物溶液；(2.4)将脐带血干细胞提取物溶液，冻干制得脐带血干细胞活性物冻干粉；(3)脐带间充质干细胞活性物冻干粉末与脐带血干细胞活性物冻干粉混合。其中，所述的步骤(1.2)具体包括以下步骤：在脐带组织中注射膨胀液后，用生理盐水对脐带组织进行洗涤；加入II型胶原酶溶液，进行消化后，离心消化产物，去除上层组织，保留沉淀和部分中间层溶液，得到原代原代脐带干细胞。所述的步骤(1.3)中的第五代脐带间充质干细胞的培育方法为：将所述原代脐带干细胞接种于干细胞培养基中，在37℃、5v/v％CO2的条件下培养，在培养7天，观察到细胞集落，并继续培养；当细胞融合度达80～85％时，用生理盐水温和冲洗培养容器的底部，冲洗2次，加入4～5毫升消化液，室温放置30秒，并在显微镜下观察细胞背景变透亮，细胞间隙变大的时候加入5毫升完全培养基终止消化，并反复冲培养容器底部，将细胞悬液转移到毫升离心管中，混匀计数，按照1×105密度接种传代，培养2～4天后细胞密度达到80～85％时，重复以上操作获得第五代脐带间充质干细胞。所的步骤(1.4)的超滤浓缩包括以下步骤：在4℃的环境下对获得溶液进行超滤浓缩，用孔径0.2nm的超滤膜过滤，过滤的压力为0.35Mpa，超滤后浓缩上清液体，将10L液体超滤至500-800ml。所述的步骤(1.5)的真空冷冻干燥包括以下步骤：冷冻干燥机设定-30℃预冷4小时；温度下降到-25℃，在-5帕压下，操作12h，将溶液成分冻干成粉末状；温度升温到30℃，保持-5帕压力，继续干燥1小时。所述的冻干保护剂，由以下物质按照质量份数组成：质量浓度为1％的右旋糖苷0.01～0.02，质量浓度为0.5％的海藻糖0.5～0.8份，质量浓度为1.5％的甘露醇1.5～2.0份，质量浓度为0.5％精氨酸0.5～2.0份。进一步的，所述的步骤(2.1)传代培养，条件为：DMEM/F12培养基中加入体积比10％的胎牛血清，培养基的pH为7.0，放入培养箱中，培养温度为37℃，湿度为95％。所述的步骤(2.4)冻干条件为，1ml/支分装冻干，冻干的温度为-20～-35℃，真空度为50～200Pa，冻干时间为24～36小时。本专利技术提供的一种脐带间充质干细胞活性物与脐带血干细胞活性物的复合物的制备方法，所得的制剂具有更好促进皮肤烫伤修复的作用，能促进皮肤烫伤的创面愈合、更好地促进其表皮的再生化、皮肤细胞增殖再生能力等作用，具有极佳的临床应用价值。具体实施方式为了使本领域相关技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。一种脐带间充质干细胞活性物与脐带血干细胞活性物的复合物的制备方法，包括以下步骤：(1)获得脐带间充质干细胞活性物；(1.1)提取脐带组织；(1.2)利用所述脐带组织制备原代脐带干细胞；在脐带组织中注射膨胀液后，用生理盐水对脐带组织进行洗涤；加入II型胶原酶溶液，进行消化后，离心消化产物，去除上层组织，保留沉淀和部分中间层溶液，得到原代原代脐带干细胞。(1.3)利用所述原代脐带干细胞培育第五代原代脐带间充质干细胞，并获得细胞培养上清液；第五代脐带间充质干细胞的培育方法为：将所述原代脐带干细胞接种于干细胞培养基中，在37℃、5v/v％CO2的条件下培养，在培养7天，观察到细胞集落，并继续培养；当细胞融合度达80～85％时，用生理盐水温和冲洗培养容器的底部，冲洗2次，加入4～5毫升消化液，室温放置30秒，并在显微镜下观察细胞背景变透亮，细胞间隙变大的时候加入5毫升完全培养基终止消化，并反复冲培养容器底部，将细胞悬液转移到毫升离心管中，混匀计数，按照1×105密度接种传代，培养2～4天后细胞密度达到80～85％时，重复以上操作获得第五代脐带间充质干细胞。(1.4)将所述细胞培养上清液进行离心，收集上清溶液，并对所述上清溶液进行过滤；然后进行超滤浓缩；超滤浓缩包括以下步骤：在4℃的环境下对获得溶液进行超滤浓缩，用孔径0.2nm的超滤膜过滤，过滤的压力为0.35Mpa，超滤后浓缩上清液体，将10L液体超滤至500-800ml。(1.5)超滤浓缩后加入冻干保护剂，并进行真空冷冻干燥，得到脐带间充质干细胞活性物冻干粉末；真空冷冻干燥包括以下步骤：冷冻干燥机设定-30℃预冷4小时；温度下降到-25℃，在-5帕压下，操作12h，将溶液成分冻干成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脐带间充质干细胞活性物与脐带血干细胞活性物的复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)获得脐带间充质干细胞活性物；/n(1.1)提取脐带组织；/n(1.2)利用所述脐带组织制备原代脐带干细胞；/n(1.3)利用所述原代脐带干细胞培育第五代原代脐带间充质干细胞，并获得细胞培养上清液；/n(1.4)将所述细胞培养上清液进行离心，收集上清溶液，并对所述上清溶液进行过滤；然后进行超滤浓缩；/n(1.5)超滤浓缩后加入冻干保护剂，并进行真空冷冻干燥，得到脐带间充质干细胞活性物冻干粉末；/n(2)获得脐带血干细胞活性物；/n(2.1)获得脐带血，放入培养箱中，恒温恒湿持续进行传代培养；/n(2.2)弃去培养基，分离得到脐带血干细胞溶液；/n(2.3)将脐带血干细胞溶液冻结，然后在4～8℃的温度下解冻，如此反复冻融至细胞完全破碎，采用孔径为0.22μm的过滤膜过滤，除去杂质，得到脐带血干细胞提取物溶液；/n(2.4)将脐带血干细胞提取物溶液，冻干制得脐带血干细胞活性物冻干粉；/n(3)脐带间充质干细胞活性物冻干粉末与脐带血干细胞活性物冻干粉混合。/n

【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞活性物与脐带血干细胞活性物的复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获得脐带间充质干细胞活性物；
(1.1)提取脐带组织；
(1.2)利用所述脐带组织制备原代脐带干细胞；
(1.3)利用所述原代脐带干细胞培育第五代原代脐带间充质干细胞，并获得细胞培养上清液；
(1.4)将所述细胞培养上清液进行离心，收集上清溶液，并对所述上清溶液进行过滤；然后进行超滤浓缩；
(1.5)超滤浓缩后加入冻干保护剂，并进行真空冷冻干燥，得到脐带间充质干细胞活性物冻干粉末；
(2)获得脐带血干细胞活性物；
(2.1)获得脐带血，放入培养箱中，恒温恒湿持续进行传代培养；
(2.2)弃去培养基，分离得到脐带血干细胞溶液；
(2.3)将脐带血干细胞溶液冻结，然后在4～8℃的温度下解冻，如此反复冻融至细胞完全破碎，采用孔径为0.22μm的过滤膜过滤，除去杂质，得到脐带血干细胞提取物溶液；
(2.4)将脐带血干细胞提取物溶液，冻干制得脐带血干细胞活性物冻干粉；
(3)脐带间充质干细胞活性物冻干粉末与脐带血干细胞活性物冻干粉混合。


2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞活性物与脐带血干细胞活性物的复合物的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1.2)具体包括以下步骤：在脐带组织中注射膨胀液后，用生理盐水对脐带组织进行洗涤；加入II型胶原酶溶液，进行消化后，离心消化产物，去除上层组织，保留沉淀和部分中间层溶液，得到原代原代脐带干细胞。


3.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞活性物与脐带血干细胞活性物的复合物的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1.3)中的第五代脐带间充质干细胞的培育方法为：将所述原代脐带干细胞接种于干细胞培养基中，在37℃、5v/v％CO2的条件下培养，在培养7天，观察到细胞集落，并继续培养；当细胞融合度达80～85％时，用生理盐水温和冲洗培养容器的底部，冲洗2次，加入4～5毫升消化液，室温放置30秒，并在显微镜下...

【专利技术属性】
技术研发人员：马亚东，黄宗堂，曹娜，
申请(专利权)人：丰泽康生物医药深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44