一种非柱状上皮干细胞培养基及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种非柱状上皮干细胞培养基，包含以下组分：cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂。本发明专利技术还公开了利用所述培养基进行非柱状上皮干细胞培养的方法。本发明专利技术所述非柱状上皮干细胞培养基突破现有技术瓶颈，使得长时间单克隆培养成为可能，能够支持层状/假层状/移型上皮等多种非柱状上皮干细胞在体外分离后以细胞池或单细胞形式高效地、稳定地扩增，是实现干细胞病理缺陷鉴定及进行后续功能修复的技术前提，可服务于细胞精准医疗产品的开发和制备。

【技术实现步骤摘要】
一种非柱状上皮干细胞培养基及培养方法
本专利技术属于干细胞培养
，具体涉及一种非柱状上皮干细胞培养基及培养方法。
技术介绍
干细胞研究是再生医学发展的重要基础和核心推动力。胚胎干细胞、诱导性干细胞和组织成体干细胞是干细胞研究领域的三大分支。凭借细胞安全性高、易于获取的显著优势，组织成体干细胞越来越多的受到干细胞医学行业的关注。组织成体干细胞进一步下分为间充质干细胞与上皮组织干细胞两大类。其中来源于骨髓、脂肪、脐带等组织的间充质干细胞由于分离培养相对简单，被广泛用于治疗移植抗宿主病、神经系统疾病及关节炎症等方面研究。然而，实质器官疾病的发生与组织修复与其上皮组织干细胞戚戚相关，治疗手段直接依赖于对相应上皮组织干细胞的认知和利用。不同上皮类型的组织干细胞，例如层状/假层状、移型、柱状上皮干细胞等，具有很高的组织忠实度，即专能分化能力，能在体外自觉定向分化为与来源组织细胞组成类型相一致的各类细胞。然而，不同上皮类型的组织干细胞在体外克隆、增殖阶段对培养微环境有不同的喜好与需求。如何营造最契合的体外微环境以支持稳定、高效、便捷的组织干细胞扩增是急需深入探索有待开发的关键
自此类干细胞1975年被首次发现至今，受限于培养技术条件，行内对上皮组织干细胞的研究和利用仍十分有限，取得关键突破的团队相对集中。至今已报道的培养技术有以下几种：(1)基于肠道柱状细胞建立的“细胞类器官”organoidculture培养法(Clevers,Cell,2016)；(2)本专利技术人参与开发的基于肠道干细胞的单克隆培养分化平台(Wang,etal.,Nature,2015)；(3)基于皮肤上皮细胞建立的滋养层细胞培养法(RheinwaldandGreen,Cell,1975；BarrandonandGreen,PNAS,1987)。其中，细胞类器官培养法是对组织干细胞、中间态细胞、终端分化细胞进行的一种混合培养方式，其优势在于能够由培养系统自发生成干细胞生长所需的大部分分泌蛋白及信号调控因子，模拟体内微环境，适合对不熟悉的组织干细胞进行短期的体外维系。但是，此培养系统无法进行单细胞层面的研究，对了解干细胞的分化潜能、谱系、病理基因缺陷，以及细胞治疗领域的编辑应用等方面操作是很大的制约；利用DrGreen培养法，层状上皮干细胞，以皮肤上皮干细胞与角膜上皮干细胞为代表，能够通过体外扩增完成制备，并分别于1981年和2008年成功用于临床再生。但是对于更多的非柱状上皮干细胞(如呼吸道上皮、泌尿道上皮等)，尤其是其单细胞克隆的体外长期稳定培养仍是瓶颈。现有培养体系无法对层状/假层状上皮干细胞的体外扩增提供足够长时间的稳定支撑。干细胞克隆在一定次数传代后呈渐减式生长、出现“老化”现象。现有条件难以实现层状/假层状上皮干细胞单细胞克隆及后续有效扩增。此技术平台的空白制约了对不同上皮组织干细胞的持续发掘以及更多新型干细胞治疗产品的开发。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种非柱状上皮干细胞培养基，其使得长时间单克隆培养成为可能，能够支持层状/假层状/移型上皮等多种非柱状上皮干细胞在体外分离后以细胞池或单细胞形式高效地、稳定地扩增。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种非柱状上皮干细胞培养基，包含以下组分：cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂。所述cFAD培养液包含以下组分：Ham’sF(25％，v/v)、含胎牛血清(10％，v/v)的DMEM(75％，v/v)、IGF(1-10μg/ml)、triiodothyronine(1-10μg/ml)、hydrocortisone(0.1-1μg/ml)和EGF(1-10ng/ml)。优选地，所述TGFβ通路抑制剂包含以下浓度的组分：1-10μMTGFβ1-4抑制剂和1-10μMALK抑制剂。本专利技术对TGFβ1-4抑制剂的种类并不限制，所有能抑制TGFβ通路的TGFβ1-4抑制剂均在本专利技术保护范围内，例如LY2157299、SB525334、LY2109761，但不限于此。本专利技术对ALK抑制剂的种类并不限制，所有能抑制ALK通路的ALK抑制剂均在本专利技术保护范围内，例如DMH1、LDN-214117、LDN-193189，但不限于此。优选地，所述ROCK抑制剂浓度为0.01-5μM。所述ROCK为Rho相关的卷曲蛋白激酶。本专利技术对ROCK抑制剂的种类并不限制，所有能抑制Rho相关的卷曲蛋白激酶的抑制剂均在本专利技术保护范围内，例如Thiazovivin、GSK429286A、GSK269962A，但不限于此。本申请专利技术人发现，包含cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂的非柱状上皮干细胞培养基能显著提高非柱状上皮干细胞的增殖速率、抑制非目的性分化，实现非柱状上皮干细胞的扩增及单细胞克隆培养。优选地，所述非柱状上皮干细胞培养基还包含以下组分：Wnt通路激活剂和FGF蛋白。优选地，所述Wnt通路激活剂包含Wnt激活蛋白和/或GSK-3抑制剂；所述Wnt激活剂浓度为0.05-2μg/ml，所述GSK-3抑制剂浓度为0.1-1μg/ml。所述GSK-3为糖原合成酶激酶-3。本专利技术对Wnt激活剂的种类并不限制，所有能激活Wnt通路的Wnt激活剂均在本专利技术保护范围内，例如Cristin3、RSPO2、WntAgonist1，但不限于此。本专利技术对GSK-3抑制剂的种类并不限制，所有能抑制糖原合成酶激酶-3的抑制剂均在本专利技术保护范围内，例如CHIR-99021、CHIR-98014、LY2090314，但不限于此。所述FGF为成纤维细胞因子。优选地，所述FGF蛋白浓度为0.05-2μg/ml。本申请专利技术人经过大量的研究和统计分析发现，在cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂基础上增加Wnt通路激活剂和FGF蛋白的非柱状上皮干细胞培养基在用于培养非柱状上皮干细胞时，具有协同增效的作用，干细胞克隆形态、成克隆率、增殖速率经过连续传代后仍然维持良好，无明显细胞老化，培养效果比只含cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂的培养基效果更好，能够更稳定支持非柱状上皮干细胞单细胞克隆的长期体外扩增并且保持干细胞分化潜能。优选地，所述非柱状上皮干细胞培养基还包含BMP抑制剂。所述BMP为骨形态发生蛋白。本专利技术对BMP抑制剂的种类并不限制，所有能抑制骨形态发生蛋白的抑制剂均在本专利技术保护范围内。优选地，所述BMP抑制剂包含头蛋白，所述头蛋白浓度为0.05-2μg/ml。本专利技术还提供了一种非柱状上皮干细胞培养方法，包括以下步骤：(1)采集上皮组织样本，切细后消化、清洗，得到含干细胞的上皮细胞悬浮液；(2)将步骤(1)获得的上皮细胞悬浮液种植于Swiss3T3鼠成纤维细胞滋养层上，用cFAD培养液进行原代培养，待细胞贴壁生长后，每周换液2-3次；(3)原代培养5-15天后，利用所述的非柱状上皮干细胞培养基进行后续扩增及单细胞克隆培养。优选地，所述步骤(1)中采集上皮组织样本的方式可以为以下任一种：无创液体样本、组织活检钳取、活检刷取、手术切取。优选地，所述步骤(1)中采集上皮组织样本后存放于组织采集液中；所述组织采集液包含以下组分：含体积比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非柱状上皮干细胞培养基，其特征在于，包含以下组分：cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂。

【技术特征摘要】
1.一种非柱状上皮干细胞培养基，其特征在于，包含以下组分：cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂。2.根据权利要求1所述的非柱状上皮干细胞培养基，其特征在于，所述TGFβ通路抑制剂包含以下浓度的组分：1-10μMTGFβ1-4抑制剂和1-10μMALK抑制剂。3.根据权利要求1所述的非柱状上皮干细胞培养基，其特征在于，所述ROCK抑制剂浓度为0.01-5μM。4.根据权利要求1～3任一项所述的非柱状上皮干细胞培养基，其特征在于，还包含以下组分：Wnt通路激活剂和FGF蛋白。5.根据权利要求4所述的非柱状上皮干细胞培养基，其特征在于，所述Wnt通路激活剂包含Wnt激活蛋白和/或GSK-3抑制剂；所述Wnt激活剂浓度为0.05-2μg/ml，所述GSK-3抑制剂浓度为0.1-1μg/ml。6.根据权利要求4所述的非柱状上皮干细胞培养基，其特征在于，所述FGF蛋白浓度为0.05-2μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪玥，
申请(专利权)人：洪玥，
类型：发明
国别省市：广东,44