本发明专利技术涉及一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基，其配方如下：每100mLDMEM/F12中加入以下浓度组分：去除外泌体的血清替代物0.5mL；L‑谷氨酰胺0.1mmol；非必需氨基酸0.1mmol；β‑巯基乙醇0.01mmol。本发明专利技术提取培养基可用于提取诱导多能干细胞来源的外泌体，能够保持诱导多能干细胞多能性状态，对细胞的活性和干特性不会造成影响，最大限度地保持干细胞来源的外泌体特性，具有巨大的应用前景。
A culture medium for extracting exosomes from induced pluripotent stem cells and its preparation method and a method for extracting exosomes by using it
The present invention relates to a medium for extracting exosomes from induced pluripotent stem cells. The formulation is as follows: adding the following concentration components every 100 mLDMEM/F12: 0.5mL serum substitute for removing exosomes; 0.1mmol L glutamine; 0.1mmol non-essential amino acid; 0.01mmol beta mercaptoethanol. The extracting medium of the invention can be used to extract exosomes from induced pluripotent stem cells, can maintain the pluripotent state of induced pluripotent stem cells, has no effect on the activity and dry characteristics of cells, and maintains the exosome characteristics of stem cells to the maximum extent, and has great application prospects.
【技术实现步骤摘要】
一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法
本专利技术属于细胞生物学与生物
，尤其是一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法。
技术介绍
外泌体是一种由真核细胞的多泡内涵体与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的脂质双层膜性小囊泡，其组成包括蛋白质、mRNA、microRNA和细胞器调控受体等各类生物活性分子。外泌体能够选择性地在不同细胞间进行物质运输与信息传递，并参与抗原呈递、血管新生、RNA转运、组织修复再生、免疫激活与抑制等多种生物调节功能。近期研究证实，多种细胞能够分泌外泌体，而外泌体内含有的活性物质及其参与的生物调节功能与其细胞来源密切相关。诱导多能干细胞是一类与胚胎干细胞类似，具有多向分化潜能并能够持续自我更新的未分化细胞，利用干细胞移植治疗是治愈多种疾病的突破口。但由于干细胞移植会有成瘤风险，阻碍了其进一步应用。诱导多能干细胞来源的外泌体富含其来源细胞的特异性蛋白如Wnt-3、Oct-4蛋白及编码Oct-4、GATA-2、GATA-4、Nanog等早期多潜能性转录因子和MMP-9mRNA，利用干细胞来源的外泌体能够上调抗凋亡基因的表达，抑制受体细胞损伤后的凋亡，修复损伤组织，促进残余细胞增殖与再生。因此，无论是对诱导多能干细胞外泌体的理论研究还是临床应用都极具价值。不同的培养方式及分离、收集方法都会影响外泌体特性及其内含的蛋白质、mRNA及microRNA等。诱导多能干细胞的培养方式复杂，需要滋养层细胞或含有多种添加物的培养基才能维持细胞的多能性和自我更新能力。而现有文献报道中外泌体收集培养基多采用无血清或低浓度去除外泌体的胎牛血清培养基，比如DMEM/F12+0.5％FBS，但无血清培养基因缺乏养分会致使细胞凋亡；而胎牛血清又因成份复杂，会影响诱导多能干细胞的未分化状态，导致其来源的外泌体失去干细胞特异性，严重影响其理论研究和临床应用的价值。因此建立一套完整的诱导多能干细胞外泌体提取培养基的制备及应用方法具有重要的实用价值。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的不足之处，针对现有诱导多能干细胞外泌体的提取培养基会影响细胞的未分化状态或使细胞凋亡，从而导致收集的外泌体丢失其来源细胞的特性，使其理论研究及临床应用失去价值这一现状，提供一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法，该提取培养基可用于提取诱导多能干细胞来源的外泌体，能够保持诱导多能干细胞多能性状态，对细胞的活性和干性不会造成影响，最大限度地保持干细胞来源的外泌体特性，具有巨大的应用前景。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基，其配方如下：每100mLDMEM/F12中加入以下浓度组分：而且，所述去除外泌体的血清替代物的制备步骤如下：将血清替代物置于超速离心管中离心，120000g、4℃，离心16小时，吸管小心抽取上清，即得去除外泌体的血清替代物，分装后于-20℃保存。而且，所述血清替代物为KnockOutTM血清替代物。如上所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基的制备方法，步骤如下：以DMEM/F12为基础培养基，添加去除外泌体的血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和β-巯基乙醇，混匀后，即得诱导多能干细胞外泌体提取培养基。利用如上所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基的提取外泌体的方法，步骤如下：⑴诱导多能干细胞的培养：将诱导多能干细胞接种到由基质胶预包被的培养板中，加入人ES/iPS培养基，每天换液；⑵诱导多能干细胞培养上清的收集：待诱导多能干细胞铺满培养板板底70％时，换为诱导多能干细胞外泌体提取培养基，每天收集培养上清，连续收集5天；⑶膜过滤结合超速离心分离外泌体：将收集培养上清在4℃条件下，300g离心10min，去除悬浮细胞；0.45μm滤膜过滤，进一步去除细胞和细胞碎片；超滤管浓缩培养上清，浓缩60-80倍；0.22μm滤膜过滤，去除大直径颗粒；120,000g4℃条件下超速离心90min，所得沉淀即为外泌体，留取沉淀，PBS溶解，备用。而且，所述步骤⑴中基质胶为Matrigel，所述人ES/iPS干细胞无血清培养基为mTeSRTM1培养基。而且，所述由基质胶预包被的培养板为由质量浓度为4％的Matrigel、4℃包被过夜的培养板。而且，所述每天为20-28小时。而且，所述步骤⑶中超滤管浓缩培养上清时使用10KDAmiconUltra15进行浓缩。本专利技术取得的优点和积极效果为：1、本专利技术提取培养基可用于提取诱导多能干细胞来源的外泌体，能够保持诱导多能干细胞多能性状态，对细胞的活性和干性不会造成影响，最大限度地保持干细胞来源的外泌体特性，具有巨大的应用前景。2、本专利技术提取培养基中采用去除外泌体的血清替代物代替胎牛血清，特别是采用了成份确定的KnockOutTM血清替代物，有效地避免了胎牛血清会导致诱导多能干细胞分化的问题，使提取的外泌体具备干细胞的特性，提高了诱导多能干细胞外泌体的利用价值；而且本专利技术提取培养基添加了L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和β-巯基乙醇等各类物质，达到了很好的复合增效作用，从而有效地减低了在外泌体收集过程中其来源干细胞的分化和凋亡，在基础研究和临床应用上具有巨大的价值。3、本专利技术首次使用去除外泌体的血清替代物并添加L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和β-巯基乙醇配制诱导多能干细胞外泌体提取培养基，在外泌体的收集中产生意想不到的效果，可以连续5天有效地收集诱导多能干细胞来源的外泌体，且不会对细胞活性和干细胞特性造成影响，效果十分理想，无论是在基础科研还是临床应用中都具有很大的应用价值。4、诱导多能干细胞对培养条件要求苛刻，需要滋养层细胞或添加多能细胞因子维持其未分化状态和活力，KnockOutTM是一种血清替代物，成分确定，既能够为诱导多能干细胞的培养提供所需养分，又不会引起其分化；KnockOutTM中含有大量的外泌体，采用过夜超速离心的方式制备ED-KSR能够有效地去除其中的外泌体成分，不会使后续的细胞来源的外泌体提取增加混杂因素。5、使用本专利技术提取培养基收集外泌体后，诱导多能干细胞仍能保持多能分化状态，碱性磷酸酶染色阳性，表达多能干细胞标志。附图说明图1为本专利技术中应用提取培养基提取诱导多能干细胞外泌体的电镜图；图2为本专利技术中应用提取培养基提取诱导多能干细胞外泌体的WesternBlot图；图3为本专利技术中应用提取培养基培养诱导多能干细胞1、3、5天后碱性磷酸酶染色图；图4为本专利技术中应用提取培养基培养诱导多能干细胞1、3、5天后免疫荧光染色图；图5为本专利技术中应用提取培养基培养诱导多能干细胞1、3、5天后流式细胞术检测细胞凋亡情况图。具体实施方式下面详细叙述本专利技术的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。本专利技术中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本专利技术中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基，其配方如下：每100mLDMEM/F12中加入以下浓度组分：较优地，所述去除外泌体的血清替代物的制备步骤如下：将血清替代物置于超速离心管中离心，120000g、4℃，离心16本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基，其特征在于：其配方如下：每100mL DMEM/F12中加入以下浓度组分：
【技术特征摘要】
1.一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基，其特征在于：其配方如下：每100mLDMEM/F12中加入以下浓度组分：2.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基，其特征在于：所述去除外泌体的血清替代物的制备步骤如下：将血清替代物置于超速离心管中离心，120000g、4℃，离心16小时，吸管小心抽取上清，即得去除外泌体的血清替代物，分装后于-20℃保存。3.根据权利要求3所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基，其特征在于：所述血清替代物为KnockOutTM血清替代物。4.如权利要求1至3任一项所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基的制备方法，其特征在于：步骤如下：以DMEM/F12为基础培养基，添加去除外泌体的血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和β-巯基乙醇，混匀后，即得诱导多能干细胞外泌体提取培养基。5.利用如权利要求1至3任一项所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基的提取外泌体的方法，其特征在于：步骤如下：⑴诱导多能干细胞的培养：将诱导多能干细胞接种到由基质胶预包被的培养板中，加入人ES/iPS培养基，每天换液；⑵诱导多能干细胞培养上清的收集：待诱导多能干细胞铺满培养板板底70％时，换为诱导多能干...
【专利技术属性】
技术研发人员：骆莹，高英堂，王鹏，高敦芹，李成龙，
申请(专利权)人：天津市第三中心医院，
类型：发明
国别省市：天津,12
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