一种奶牛肝干细胞的分离提取方法技术

本发明专利技术涉及一种奶牛肝干细胞的分离提取方法，属于细胞工程技术领域。本发明专利技术通过优化灌流法的操作步骤，结合Percoll液分离技术，建立了一种简便易行，提取效率高的奶牛肝干细胞分离提取方法。该方法用时短，可以减少离体组织细胞暴露在缺血缺氧环境中的时间，提高细胞活力达90％以上，分离得到的肝干细胞具有双向分化潜能，为解决体外研究奶牛疾病过程中所需的肝干细胞来源问题及奶牛营养代谢病发病机制提供支持。

【技术实现步骤摘要】
一种奶牛肝干细胞的分离提取方法
本专利技术涉及一种奶牛肝干细胞的分离提取方法，属于细胞工程

技术介绍
近年来，我国规模化奶牛养殖模式飞速发展，大规模舍饲的管理模式在带来更高生产效益的同时也对奶牛的健康产生一定的影响。不同生理阶段的奶牛需要不同的能量摄入，但是目前奶牛的管理精细化程度远远不够，统一饲喂会带来更高的营养代谢风险。在分群不及时的情况下，围产期牛群中容易发生能量和物质代谢障碍。肝脏在动物体内承担着能量储存代谢、胆汁合成运输、氨基酸利用，解毒等多种重要生理功能。利用体外肝细胞模型研究奶牛代谢相关疾病的发生机制具有十分重要的意义。以往我们认为在体内发生急性肝损伤时成熟肝细胞在体内能够迅速进行细胞分裂，不断复制以修复肝脏组织功能，说明肝细胞本身就具有很强的增殖能力。但是体外培养的原代肝细胞会失去增殖能力，且容易发生细胞凋亡。体外培养的原代肝细胞通常只能存活一到两周左右，这一缺陷大大增加了肝细胞的获取成本，限制了肝细胞相关实验的开展。众所周知，干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，具有强大的自我增殖及分化潜能，研究表明干细胞体外培养可定向诱导为成熟肝细胞，这为肝细胞来源问题提供了一个新的思路。细胞根据功能可分为全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。全能干细胞如胚胎干细胞，虽然在体外增殖及活力上有不可比拟的优势，但存在可塑性差，分化率低等缺陷。肝脏中存在特异性的肝干细胞，并能够体外诱导分化成功能性肝细胞或胆管细胞。目前分离肝干细胞的方法多以两步灌流法为基础，再结合免疫磁珠分选、Percoll密度梯度离心或胰蛋白酶多次消化来分离肝干细胞。用免疫磁珠法分离细胞得率有限，且不利于后续培养；而用胰蛋白酶多次差速消化对细胞伤害较大，操作繁琐且细胞纯度不够。申请公布号为CN102787096A的中国专利技术专利申请公开了小鼠肝窦内皮细胞的提取方法。该方法结合了两步灌流、差速离心、Percoll离心、差速贴壁技术实现肝窦内皮细胞的分离。但该方法操作复杂，实验过程用时较长，成本较高。目前未发现更简单易行肝干细胞分离方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种奶牛肝干细胞的分离提取方法，该方法耗时短，操作简便。为实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种奶牛肝干细胞的分离提取方法，包括如下步骤：(1)取奶牛肝脏用灌流液A进行灌流，流速为45～55mL/min，灌流时间为10～15min；观察到肝脏颜色呈土黄色且无颜色变化时，继续灌流2～3min；(2)用灌流液B继续灌流，流速为45～55mL/min，灌流时间为2～3min；(3)用灌流液C继续灌流13～17min，灌流速度为15～25mL/min；(4)将肝脏组织终止消化后，过筛网得到组织悬液；(5)将步骤(4)中的组织悬液离心，取沉淀即得肝脏非实质细胞；(6)将肝脏非实质细胞重悬得细胞悬液；(7)将上述细胞悬液加入到Percoll液上方，离心弃上清及分离液，即得肝干细胞。上述奶牛肝干细胞的分离提取方法耗时短、操作简便、成本较低，通过该分离提取方法得到的肝干细胞细胞活力达90％以上。上述奶牛肝干细胞的分离提取方法中，灌流液A包括以下重量份数的组分：NaCl8～8.2份、KCl0.4～0.6份、葡萄糖0.4～0.5份、HEPES2～3份、EDTA0.1～0.2份；灌流液B包括以下重量份数的组分：NaCl8～8.2份、KCl0.4～0.6份、葡萄糖0.4～0.5份、HEPES6～7份、CaCl20.5～0.7份；灌流液C是将IV型胶原酶溶于灌流液B中得到的。上述灌流液的组分配比可以达到更好的灌流效果。本专利技术在奶牛肝干细胞的分离提取过程中，灌流液A的用量为600～900mL或600～800mL。上述奶牛肝干细胞的分离提取方法中，所述的灌流液A、灌流液B、灌流液C均经36～38℃预热。36～38℃更接近奶牛的体温，在36～38℃温度下预热可以达到更好的分离效果。步骤(4)中所述的终止消化采用胎牛血清进行。胎牛血清可以终止肝脏的消化。步骤(4)中所述的筛网目数为80～180目。筛网目数在80～180目时可以将杂质去除，得到较纯的肝脏组织悬液。步骤(5)中所述的离心方法为先在50～55g的转速下离心5～10min，再在200～220g的转速下离心5～10min。通过该离心方法可以将悬浮于肝脏组织悬液中的肝脏非实质细胞沉淀析出。步骤(6)中所述细胞悬液的密度为1×106cells/mL。采用1×106cells/mL密度细胞悬液进行纯化，能有效提高纯化细胞回收效率。步骤(7)中所述的Percoll液质量百分数为50％，所述离心的条件为4℃离心10min，转速为600g。质量百分数为50％的Percoll液，肝干细胞分离纯化效果更好，4℃离心可以防止离心过程中的温度较高而降低肝干细胞的活力。步骤(7)中所述的Percoll液和细胞悬液的体积比略大于1:1。体积比略大于1:1，能得到纯化后清晰的分界。本专利技术的有益效果：本专利技术通过优化两步灌流法操作步骤，结合Percoll液分离技术，建立了一种简便易行，提取效率高的奶牛肝干细胞分离提取方法。该方法用时短，可以减少离体组织细胞暴露在缺血缺氧环境的时间，提高细胞活力达90％以上，分离得到的肝干细胞具有双向分化潜能，为解决体外研究奶牛疾病过程中所需的肝细胞来源问题及奶牛营养代谢病发病机制提供支持。附图说明图1为本专利技术中奶牛肝干细胞的分离纯化的对比例2中多密度Percoll分离液纯化结果的显示照片；图2为本专利技术中奶牛肝干细胞的分离纯化的实施例中50％单密度Percoll分离液纯化结果的显示照片；图3为本专利技术中奶牛肝干细胞的分离纯化的实施例中50％单密度梯度纯化后的离心结果的显示照片；图4为本专利技术中肝干细胞与肝细胞分离纯化的试验例2中奶牛肝干细胞放大倍数50×的显示照片；图5为本专利技术中肝干细胞与肝细胞分离纯化的试验例2中奶牛肝细胞放大100×的显示照片；图6为本专利技术中肝干细胞的原代培养的试验例3中奶牛肝干细胞原代培养结果的显示照片；图7为本专利技术中肝干细胞的传代培养的试验例4中奶牛肝干细胞传代培养结果的显示照片；图8为本专利技术中P3代细胞HE染色鉴定的试验例5中P3代肝干细胞HE染色结果的显示照片；图9本专利技术中P3代细胞免疫荧光染色的试验例6中P3代肝干细胞荧光免疫染色结果的显示照片；图1中，1代表70％Percoll层，2代表50％Percoll层，3代表其他细胞悬液，4代表肝干细胞层；图2中，5代表其他细胞悬液，6代表50％Percoll层；图3中，7代表离心后的肝干细胞；图6中，a-c放大倍数为200×，d-f放大倍数为50×；其中图a为培养72h细胞形态的显示照片，图b为培养96h细胞形态的显示照片，图c-e为继续培养一周内的不同时刻的细胞形态变化的显示照片，图f为图c-e继续培养到10d后的细胞形态显示照片；图7中，a为P0代的细胞状态显示图，b为P1代细胞状态显示图，c、d为P2代细胞状态显示图，e、f为P3代细胞状态显示图；图8中，a、c标尺为100μm，b、d标尺为50μm；图9中各图的标尺为100μm，其中，a1、a2、a3、a4、a5分别为CY3荧光染料标记的C-KIT、CD34、EpCAM、CK18、CK19阳性表达效果图，相应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种奶牛肝干细胞的分离提取方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)取奶牛肝脏用灌流液A进行灌流，流速为45～55mL/min，灌流时间为10～15min；观察到肝脏颜色呈土黄色且无颜色变化时，继续灌流2～3min；(2)用灌流液B继续灌流，流速为45～55mL/min，灌流时间为2～3min；(3)用灌流液C继续灌流13～17min，灌流速度为15～25mL/min；(4)将肝脏组织终止消化后，过筛网得到组织悬液；(5)将步骤(4)中的组织悬液离心，取沉淀即得肝脏非实质细胞；(6)将肝脏非实质细胞重悬得细胞悬液；(7)将上述细胞悬液加入到Percoll液上方，离心弃上清及分离液，即得肝干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种奶牛肝干细胞的分离提取方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)取奶牛肝脏用灌流液A进行灌流，流速为45～55mL/min，灌流时间为10～15min；观察到肝脏颜色呈土黄色且无颜色变化时，继续灌流2～3min；(2)用灌流液B继续灌流，流速为45～55mL/min，灌流时间为2～3min；(3)用灌流液C继续灌流13～17min，灌流速度为15～25mL/min；(4)将肝脏组织终止消化后，过筛网得到组织悬液；(5)将步骤(4)中的组织悬液离心，取沉淀即得肝脏非实质细胞；(6)将肝脏非实质细胞重悬得细胞悬液；(7)将上述细胞悬液加入到Percoll液上方，离心弃上清及分离液，即得肝干细胞。2.根据权利要求1所述的奶牛肝干细胞的分离提取方法，其特征在于：灌流液A包括以下重量份数的组分：NaCl8～8.2份、KCl0.4～0.6份、葡萄糖0.4～0.5份、HEPES2～3份、EDTA0.1～0.2份；灌流液B包括以下重量份数的组分：NaCl8～8.2份、KCl0.4～0.6份、葡萄糖0.4～0.5份、HEPES6～7份、CaCl20.5～0.7份；灌流液C...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵琦，张才，王臣，王玉琴，杨自军，李元晓，汪洋，爨淑楠，王帅帅，徐文浩，闫婉婉，陈文彬，孟素丹，李鹏飞，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南,41