重编程培养基及重编程诱导多能干细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种重编程培养基及重编程诱导多能干细胞的培养方法，该重编程培养基由DMEM‑F12基础培养基和添加成分组成，所述添加成分包括60μg/mL‑180μg/mL的L‑抗坏血酸、5.3μmol/L‑74μmol/L的氢化可的松、3ng/mL‑89ng/mL的亚硒酸钠、8μmol/L‑23μmol/L的Optiferrin、0.5μmol/L‑7.4μmol/L的视黄醇乙酸酯、40ng/mL‑60ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、8μg/mL‑12μg/mL的IGF、0.2μmol/L‑0.6μg/mL的A‑83、2μmol/L‑6μmol/L的CHIR99021以及100μmol/L‑450μmol/L的丁酸钠。使用该重编程培养基不仅可以提高临床使用的安全性，还可以提高成体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率。

【技术实现步骤摘要】
重编程培养基及重编程诱导多能干细胞的培养方法
本专利技术涉及生物领域，尤其涉及一种重编程培养基及重编程诱导多能干细胞的培养方法。
技术介绍
2006年，山中伸弥的团队专利技术了一种由OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc四种转录因子构成的“鸡尾酒”法，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化多能性的干细胞，这种干细胞被称为诱导多能干细胞(inducedplμripotentstemcells，简称“iPSC”)。这些干细胞具有和胚胎干细胞(embryonicstemcells)类似的分化潜能，能够形成人体发育最基本的三个胚层，并最终形成多种成体细胞。该方法突破了在医学上使用人胚胎干细胞的伦理限制，可以解决细胞移植治疗中的免疫排斥问题，大大拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。目前，国际上多个实验室已经开发出多种重编程方法，根据重编程载体分类，可以大致分为以下四类：(1)病毒法：其中包括了基因组随即插入型病毒载体(e.g.慢病毒)和非基因组插入载体(e.g.仙台病毒)，该类方法的缺点在于基因组的随即插入所带来的潜在风险，或者冗长的病毒稀释过程带来的不变。(2)DNA法：其中包括PiggyBac、SleepingBeaμty以及Episomal在内的多种质粒类型，这类方法的特征为重编程效率低。(3)RNA法和蛋白质法：这类方法操作过程复杂，在工业应用实用性较差。(4)化合物小分子法：这是目前应用越来越广泛的一种重编程方法，但其重编程效率存在较大的个体差异。然而，目前前3种方法在诱导过程中均使用含有血清成分的重编程培养基，例如在饲养层存在的情况下使用knockoutserum或者在无饲养层的情况下使用含有N2或者B27添加剂的培养基，而且这些培养基中都还含有包括转铁蛋白在内的血清蛋白或者其他动物源性成份。由于血清蛋白成分的存在，造成了诱导多能干细胞在临床应用过程中的不便，不利于重编程的工业化诱导及标准化流程的制定。而化合物小分子法仍然需要解决个体差异大的问题，即如何在多种细胞类型实现近似等效的重编程效率仍是再生医学领域的一大难题。从分化终端的分化细胞重编程到诱导多能干细胞，目前在工业及临床应用最为广泛的重编程培养方法有两种：(1)滋养诱导法：将成体细胞在有滋养层的情况下重编程得到诱导多能干细胞并进行扩增。这种方法的缺点在于诱导多能干细胞在后续培养过程中均需要滋养细胞加以辅助培养，滋养细胞多为鼠源胚性成纤维细胞，在后续的定向分化及组织工程应用中，目的细胞容易受到滋养细胞的污染，这成为阻碍诱导多能干细胞应用的一大障碍。(2)无滋养法培养：该方法得到的诱导多能干细胞不需要滋养细胞的辅助，能够在经过大分子基质胶或者层粘蛋白的支持下持续生长。目前，无滋养层法是诱导多能干细胞的产业主流。但是无滋养层法需要细胞培养基提供复杂的营养成分，特别是血清的替代物，需要多种复合成分经过精准的浓度进行调配，从而达到既能为多能干细胞的生长提供充足的营养，同时又要保证维持多能干细胞的各种性能。但是，这两种培养方法所使用到的培养体系均使用动物血清成份作为维持细胞活力的重要原料，这使得此类培养基中含大量动植物来源蛋白，添加物质的化学成分也不够明确，会对后续处理应用造成不利影响，例如目标蛋白的分离纯化困难等，同时培养基的成本也较高。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的技术问题，提供既不使用血清成分、也不含有血清转铁蛋白的重编程培养基及利用该重编程培养重编程诱导多能干细胞的培养方法，不仅可以提高临床使用的安全性，还可以提高成体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种重编程培养基，所述重编程培养基由DMEM-F12基础培养基和添加成分组成，所述添加成分包括60μg/mL-180μg/mL的L-抗坏血酸、5.3μmol/L-74μmol/L的氢化可的松、3ng/mL-89ng/mL的亚硒酸钠、8μmol/L-23μmol/L的Optiferrin、0.5μmol/L-7.4μmol/L的视黄醇乙酸酯、40ng/mL-60ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、8μg/mL-12μg/mL的IGF、0.2μmol/L-0.6μg/mL的A-83、2μmol/L-6μmol/L的CHIR99021以及100μmol/L-450μmol/L的丁酸钠。在其中一个实施例中，所述添加成分包括70μg/mL-90μg/mL的L-抗坏血酸、40μmol/L-60μmol/L的氢化可的松、10ng/mL-30ng/mL的亚硒酸钠、8μmol/L-12μmol/L的Optiferrin、3μmol/L-6μmol/L的视黄醇乙酸酯、45ng/mL-55ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、8μg/mL-12μg/mL的IGF、0.3μmol/L-0.5μg/mL的A-83、3μmol/L-5μmol/L的CHIR99021以及280μmol/L-410μmol/L的丁酸钠。在其中一个实施例中，所述添加成分包括80μg/mL的L-抗坏血酸、50μmol/L的氢化可的松、20ng/mL的亚硒酸钠、10μmol/L的Optiferrin、4μmol/L的视黄醇乙酸酯、50ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、10μg/mL的IGF、0.4μg/mL的A-83、4μmol/L的CHIR99021以及400μmol/L的丁酸钠。一种重编程诱导多能干细胞的培养方法，利用成体细胞采用上述任一项所述的重编程培养基进行重编程培养。在其中一个实施例中，所述成体细胞为脐带来源人间质细胞、人CD34+细胞和/或人皮肤成纤维细胞。在其中一个实施例中，所述的重编程诱导多能干细胞的培养方法包括如下步骤：重编程采用Epi5ReprogrammingKit，将成体细胞重悬于电转化试剂盒中提供的ResuspensionBuffer中，电转，得电转后的细胞；将电转后的细胞打入Matrigel包被培养板的孔内，利用上述任一项所述的重编程培养基置于温度37±0.5℃、5％二氧化碳环境中进行培养，培养过程中，每天半换液至电转后的第十天，从第十天开始每隔一天换液一次，直至第28天。在其中一个实施例中，所述的重编程诱导多能干细胞的培养方法包括如下步骤：重编程使用CytoTuneTM-iPS2.0SendaiReprogrammingKit，按照2×106细胞、MOI＝5的比例进行病毒转导，病毒加入后，置于温度37±0.5℃、5％二氧化碳环境中孵育12-16h，第二天开始将培养基更换为上述任一项所述的重编程培养基，培养至第28天。在其中一个实施例中，所述的重编程诱导多能干细胞的培养方法包括如下步骤：重编程使用SimpliconTMRNAReprogrammingKit，再利用上述任一项所述的重编程培养基，将细胞培养至第28天。在其中一个实施例中，所述的重编程诱导多能干细胞的培养方法还包括使重编程的诱导多能干细胞向神经细胞分化的步骤。本专利技术的有益效果是：本专利技术的重编程培养基通过向DMEM-F12基础培养基中添加特定种类和配比的添加成分，使用纯化学因子及非动物来源的生长因子相结合的方式，不含血清成分，也不含有血清转铁蛋白，不仅可以克服常规重编程过程中动物来源成分和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重编程培养基，其特征在于，所述重编程培养基由DMEM‑F12基础培养基和添加成分组成，所述添加成分包括60μg/mL‑180μg/mL的L‑抗坏血酸、5.3μmol/L‑74μmol/L的氢化可的松、3ng/mL‑89ng/mL的亚硒酸钠、8μmol/L‑23μmol/L的Optiferrin、0.5μmol/L‑7.4μmol/L的视黄醇乙酸酯、40ng/mL‑60ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、8μg/mL‑12μg/mL的IGF、0.2μmol/L‑0.6μg/mL的A‑83、2μmol/L‑6μmol/L的CHIR99021以及100μmol/L‑450μmol/L的丁酸钠。

【技术特征摘要】
1.一种重编程培养基，其特征在于，所述重编程培养基由DMEM-F12基础培养基和添加成分组成，所述添加成分包括60μg/mL-180μg/mL的L-抗坏血酸、5.3μmol/L-74μmol/L的氢化可的松、3ng/mL-89ng/mL的亚硒酸钠、8μmol/L-23μmol/L的Optiferrin、0.5μmol/L-7.4μmol/L的视黄醇乙酸酯、40ng/mL-60ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、8μg/mL-12μg/mL的IGF、0.2μmol/L-0.6μg/mL的A-83、2μmol/L-6μmol/L的CHIR99021以及100μmol/L-450μmol/L的丁酸钠。2.根据权利要求1所述的重编程培养基，其特征在于，所述添加成分包括70μg/mL-90μg/mL的L-抗坏血酸、40μmol/L-60μmol/L的氢化可的松、10ng/mL-30ng/mL的亚硒酸钠、8μmol/L-12μmol/L的Optiferrin、3μmol/L-6μmol/L的视黄醇乙酸酯、45ng/mL-55ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、8μg/mL-12μg/mL的IGF、0.3μmol/L-0.5μg/mL的A-83、3μmol/L-5μmol/L的CHIR99021以及280μmol/L-410μmol/L的丁酸钠。3.根据权利要求2所述的重编程培养基，其特征在于，所述添加成分包括80μg/mL的L-抗坏血酸、50μmol/L的氢化可的松、20ng/mL的亚硒酸钠、10μmol/L的Optiferrin、4μmol/L的视黄醇乙酸酯、50ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、10μg/mL的IGF、0.4μg/mL的A-83、4μmol/L的CHI...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏君，
申请(专利权)人：武汉睿健医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42