一种神经干细胞诱导分化培养基及诱导分化方法技术

本发明专利技术提供了一种TGF

A culture medium and method for inducing differentiation of neural stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种神经干细胞诱导分化培养基及诱导分化方法


[0001]本专利技术属于生物领域，具体涉及外胚层细胞的培养方法、培养基，以及其在神经损伤类疾病中的应用。

技术介绍

[0002]外胚层是胚胎发育过程中形成的最外层，随着器官发生的开始，外胚层细胞逐渐分化为大脑、脊髓、感觉器官等重要的系统。其中神经系统是负责思维、情感、感知、运动等功能的重要系统。相比于肿瘤等疾病，目前神经系统疾病的药物数量较少，且研发周期漫长，其中最为重要的一个原因为外胚层谱系中多种原代细胞的特殊性，例如原代神经元的不可再生性造成了神经系统药物体外药物筛选平台的稀缺。
[0003]除了可以用于药物筛选之外，外胚层细胞的体外再生能治疗多种退行性疾病，例如神经退行性疾病是目前常见的老龄化疾病，该疾病的治疗及护理费用极其昂贵，而且市面上无特效药物可以进行有效的治疗。神经退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森病(PD)、阿尔茨海默症(AD)等疾病。世界卫生组织统计，2050年我国神经退行性疾病患者将超过3000万，预期医疗费用将超过1万亿人民币。目前主要以药物去补充或刺激脑内不足的左旋多巴、神经核团毁损术或脑深部电刺激手术等治疗方法，但均不能达到很好的疗效，并且会带来“异动症”或是“药效波动”等严重影响生活质量的不良反应。
[0004]除神经退行性疾病之外，脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是常见的一种神经系统创伤性疾病，据国外统计SCI患者一生的治疗康复费用平均达75万美元以上，美国每年对SCI患者的花费超过60亿美元。我国的患病率更是高于欧美发达国家，昂贵的治疗费用，长时间的康复治疗以及劳动力的丧失给个人及家庭带来的巨大影响，也给社会带来沉重的负担。
[0005]神经退行性疾病和脊髓损伤的研究难点在于中枢神经系统的神经细胞具有不可再生性，体外疾病模型的稀缺是基础研究的限制性因素，而这类疾病是由于中枢神经的不可逆损伤造成。神经细胞包括神经干细胞，成熟神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等不同神经细胞类型。现存的神经细胞系资源有限，多为神经系统肿瘤细胞系，且在建系过程中存在EB病毒带来的不稳定因素；神经细胞由于体外传代不易，胚胎及胎儿来源的神经干细胞由于伦理限制不便普及。目前，虽然神经干细胞的异体移植已经在临床上取得了一定的效果，但以上因素都进一步阻碍了相关疾病的临床推进。
[0006]2006年，山中伸弥的团队专利技术了一种由OCT4、SOX2、KLF4和c
‑
Myc四种转录因子构成的“鸡尾酒”法，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化多能性的干细胞，这种干细胞被称为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)(Takahashi K,et al.,Cell,2006,126(4)pp.663
‑
676；Takahashi K and Yamanaka S,Cell,2007,131(5)pp.861
‑
872)。这些干细胞具有和胚胎干细胞(embryonic stem cells)类似的分化潜能，能够形成人体发育最基本的三个胚层：外胚层、中胚层及内胚层，并最终形成多种成体细胞。这一专利技术突破了在医学上使用人胚胎干细胞的伦理限制，可以解决细
胞移植治疗中的免疫排斥问题，大大拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。使用包括胚胎干细胞及诱导多能干细胞(iPSC)在内的全能干细胞或者多能干细胞作为原材料进行外胚层细胞诱导分化可以作为临床治疗的新思路，大大拓展了外胚层细胞在临床医学上的应用潜力。
[0007]以神经系统为例，目前在再生医学领域，神经干细胞及神经元的诱导多采取SMAD途径双重抑制法(Dual SMAD inhibition)(Chambers SM,et.al.,Nat Biotechnol,2009,27(3):275
‑
80)，该方法得到的神经干细胞能够分化为其它类型的神经元细胞，其原理是通过抑制BMP和TGF
‑
β途径来模拟胚胎发育早期的信号途径，从而诱导神经干细胞的产生。其中LDN
‑
193189和SB431542是广为使用的两种化学小分子抑制剂，分别通过作用于BMP4途径中的ALK2和ALK3，以及TGF
‑
β途径中的ALK5来达到移植内胚层及中胚层形成，从而起到诱导外胚层发育及神经发生的作用。通过这种方法，可以在血清类成分(Knockout Serum Replacement)的存在下得到诱导的神经细胞(Chambers SM,et.al.,Nat Biotechnol.,2013,30(7):715
‑
720)。但使用SMAD途径双重抑制法(Dual SMAD inhibition)获得的神经细胞中经常混有其他未完全分化的细胞类型，这是由于细胞分化不同步产生的结果，这类细胞的存在会在一定层度上影响移植治疗效果，同时带来安全性的担忧。因此，如何获得高纯度的分化细胞是细胞移植急需解决的技术问题。
[0008]本专利技术使用的Galunisertib(LY2157299)，标准化学命名为4
‑
(2
‑
(6
‑
甲基吡啶
‑2‑
基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
4H
‑
吡咯并[1,2
‑
b]吡唑
‑3‑
基)喹啉
‑6‑
甲酰胺(4
‑
(2
‑
(6
‑
methylpyridin
‑2‑
yl)
‑
5,6
‑
dihydro
‑
4H
‑
pyrrolo[1,2
‑
b]pyrazol
‑3‑
yl)quinoline
‑6‑
carboxamide)；其他化学命名2
‑
(6
‑
甲基
‑
吡啶
‑2‑
基)
‑3‑
(6
‑
氨甲酰基
‑
喹啉
‑4‑
基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
4H
‑
吡咯[1,2
‑
b]吡唑(2
‑
(6
‑
Methyl
‑
pyridin
‑2‑
yl)
‑3‑
(6
‑
Carbamoyl
‑
quinolin
‑4‑
yl)
‑
5,6
‑
dihydro
‑
4H
‑
pyrrolo[1,2
‑
b本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种神经干细胞及类器官诱导培养基，其特征在于，由基础培养基和10nM～100μM神经诱导化合物组成；其中，基础培养基包括杜氏改良伊格尔/F12培养基、最低必须培养基非必需氨基酸、氯化钠、亚硒酸钠、胰岛素和重组人转铁蛋白。2.根据权利要求1所述的神经干细胞诱导培养基，其特征在于，所述基础培养基由杜氏改良伊格尔/F12培养基、1％最低必须培养基非必需氨基酸、0.1
‑
0.8g/L氯化钠、13.6μg/L亚硒酸钠、20ng/ml
‑
42μg/ml胰岛素和50
‑
180ng/ml重组人转铁蛋白组成。3.根据权利要求2所述的神经干细胞诱导培养基，其特征在于，所述基础培养基含有0.5g/L氯化钠、13.6μg/L亚硒酸钠、22ug/ml胰岛素和100ng/ml重组人转铁蛋白。4.根据权利要求3所述的神经干细胞诱导培养基，其特征在于，所述神经诱导化合物为作用于BMP或者TGF信号转导途径的物质。5.根据权利要求4所述的神经干细胞诱导培养基，其特征在于，所述作用于TGF信号转导途径的物质为TGF
‑
β抑制剂。6.根据权利要求5所述的神经干细胞诱导培养基，其特征在于，所述TGF
‑
β抑制剂为4
‑
[2
‑
(6
‑
甲基吡啶
‑2‑
基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
4H
‑
吡咯并[1,2
‑
b]吡唑
‑3‑
基]喹啉
‑6‑
羧酰胺。7.根据权利要求6所述的神经干细胞诱导培养基，其特征在于，所述TGF
‑
β抑制剂的浓度为12.5μM。8.一种诱导神经干细胞形成的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏君，蔡萌，周佳，侯梦莹，云轩，
申请(专利权)人：武汉睿健医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：