一种光感受器神经元细胞的化学诱导方法技术

本发明专利技术提供一种新的光感受器神经元细胞纯化学诱导方法，通过将一组小分子抑制剂添加至无血清基础培养基中，将多能干细胞快速转化为光感受器神经元细胞，与目前国际通行的血清加视黄醇的诱导方法相比，本发明专利技术不使用血清，使用化学小分子替代视黄醇，保证了光感受器神经元发育所需要的视觉循环的运行的同时也排除了血清的不利因素。

【技术实现步骤摘要】
一种光感受器神经元细胞的化学诱导方法
本专利技术属于生物领域。具体涉及光感受器神经元细胞的化学诱导及培养方法、培养基及其在多种疾病中的应用。
技术介绍
外胚层是胚胎发育过程中形成的最外层，随着器官发生的开始，外胚层细胞逐渐分化为大脑、脊髓、感觉器官等重要的系统。其中神经系统是负责思维、情感、感知、运动等功能的重要系统。相比于肿瘤等疾病，目前神经系统疾病的药物数量较少，且研发周期漫长，其中最为重要的一个原因是外胚层谱系中多种原代细胞的特殊性，例如原代神经元的不可再生性导致了神经系统药物体外药物筛选平台的稀缺。外胚层细胞的体外再生能解决多种退行性疾病，例如神经退行性疾病是目前常见的老龄化疾病，治疗及护理费用极其昂贵，而且市面上无特效药物可以进行有效的治疗。神经退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森病(PD)、阿尔茨海默症(AD)等疾病。世界卫生组织统计，2050年我国神经退行性疾病患者将超过3000万，预期医疗费用将超过1万亿。此类疾病的治疗难点在于中枢神经系统的神经细胞具有不可再生性，而这类疾病是由于中枢神经的不可逆损伤造成。目前，神经细胞的移植是最为有效的一种治疗方式。视觉神经的退行性疾病也是其中的一大类疾病。以与年龄相关的黄斑变性(AMD)为例，它是50岁以上人群视力受损的主要原因，其特征是视网膜退化，可导致中央视力丧失。此外，色素变性这种罕见遗传性疾病，其特征是视网膜中的光感受器逐渐退化，无法将光信号转换成向大脑的电信号。视网膜是高等动物体中能够感受“影像”的重要组织，由光敏细胞和光感受器组成。光感受器能将影像的光信号转变为神经信号，是能让大脑“看见”影像的重要细胞。这其中，锥形受体细胞即视锥细胞负责我们的日间视觉及颜色的感知，视杆细胞，则更为敏感，即使在低光照条件也可以感知到微弱的光。感光细胞的受损，是视网膜退行性疾病的重要成因，导致眼球无法将“影像”转化的神经信号传递到大脑，从而严重影响人的视力，甚至导致失明。更为严峻的是，光感受器神经细胞的受损是一种不可逆的过程，无法自我修复，因此此类疾病没有良好的治疗方法。部分患者采取视网膜移植方法，但视网膜资源有限，多来自于遗体捐赠，远不能满足临床需要；人工视网膜的原理是替换这些光感受器。该装置由固定在视网膜和电极化合物下的植入物组成，这些植入物可刺激视网膜神经元向大脑传递信息，但目前人工视网膜价格昂贵，且不能精细恢复视觉功能；除此之外，还有基于病毒载体的基因疗法，通过修正遗传突变让遗传性光感受器恢复功能，同样，基因疗法除了价格昂贵之外，并不能解决由年龄造成的视觉神经的退行性疾病。2006年，山中伸弥的团队专利技术了一种由OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc四种转录因子构成的“鸡尾酒”法，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化多能性的干细胞，这种干细胞被称为诱导多能干细胞(InducedPluripotentCells)(Cell，2006，124(4)pp.663-676；Cell，2007，131(5)pp.861-872)。这些干细胞具有和胚胎干细胞(EmbryonicStemCells)类似的分化潜能，能够形成人体发育最基本的三个胚层：外胚层、中胚层及内胚层，并最终形成多种成体细胞。这一专利技术突破了在医学上使用人胚胎干细胞的伦理限制，可以解决细胞移植治疗中的免疫排斥问题，大大拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。使用包括胚胎干细胞及iPSC在内的全能干细胞或者多能干细胞作为原材料进行外胚层细胞诱导分化可以作为临床治疗的新思路，大大拓展了外胚层细胞在临床医学上的应用潜力。以神经系统为例，目前在再生医学领域，神经干细胞及神经元的诱导多采取SMAD途径双重抑制法(DualSMADinhibition)(NatBiotechnol，2009，05；27(5)：485)，该方法得到的神经干细胞能够分化为其它类型的神经元细胞，其原理是通过抑制BMP和TGFBeta途径来模拟胚胎发育早期的信号途径，从而诱导神经干细胞的产生。其中LDN-193189和SB431542是广为使用的两种化学小分子抑制剂，分别通过作用于BMP4途径中的ALK2和ALK3，以及TGFBeta途径中的ALK5来实现移植内胚层及中胚层形成，从而起到神经发生的作用。通过这种方法，可以在血清类成分(KnockoutSerumReplacement)胎牛血清(FBS)和视黄酸的存在下得到光感受器神经元，且生产周期至少需要70天以上(STEMCELLSTRANSLATIONALMEDICINE，2018；7:210-219；SciTranslMed，2019.116；11(475))。但是血清提取物，动物源性提取物的存在，对细胞治疗领域，特别是细胞制药来说，是一种不利于药物安全性的潜在危险，例如动物源性病毒的混入，以及致敏性蛋白的存在，都可能会导致治疗效果的失败。此外，视黄酸是视觉循环的重要参与组成成分，涉及通过视网膜色素上皮(RPE)将维生素A(称为全反式视黄醇或全反式ROL)转化为11-顺式视黄醛(11-顺式-RAL)，转运11-顺式-RAL转化为感光体，产生光色素，将11-顺式-RAL异构化并还原成全反式ROL，并将全反式ROL转运回RPE参与另一个循环(Nature.1960；168:114-118；Nat.Genet.1997；15:236-246；J.Biol.Chem.1997；272:10303-10310)。细胞培养体系中的类维生素A，例如视黄酸(RA)，非常容易受到氧化而失去活性。因此，为了稳定视黄酸不被快速氧化损伤，血清被大量用来稳定细胞培养体系中的视黄酸(IntJDevBiol.2012；56(4):273-8)。因此，一种既不依赖于血清，又能在细胞培养条件下稳定存在的类维生素A化学分子，对光感受器神经元的体外稳定安全诱导极为重要。本专利技术使用的Galunisertib(LY2157299)，标准化学命名：4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide或4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉-6-甲酰胺；为TGF-β受体Ⅰ(TGF-βRI,ALK5)小分子抑制剂。LY2157299目前正处于II期临床评估，针对肝癌和胶质母细胞瘤的抗癌活性(GiannelliG1,VillaE,LahnM.TransformingGrowthFactor-βasaTherapeuticTargetinHepatocellularCarcinoma.CancerRes.2014.4.1；74(7):1890-4)，通过阻断TGF-β信号通路抑制肿瘤的生长、侵袭和转移过程；此外，多项研究表明LY2157299阻断了CTGF的产生并抑制了新血管生成，从而抑制了癌细胞的生长。目前，该分子的发展方向主要是基于肺癌、肝癌和胶质母细胞瘤的药物开发以及治疗(Pharmaceutics.2020.5.18；12本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.LY2157299在多能干细胞分化为外胚层中的应用，优选地，所述LY2157299的用量为55nM-25uM，更优选为100nM、300nM、500nM、700nM、900nM、1uM、2.5uM、5uM、7.5uM、10uM、12.5uM、15uM、17.5uM、20uM或22uM。/n

【技术特征摘要】
1.LY2157299在多能干细胞分化为外胚层中的应用，优选地，所述LY2157299的用量为55nM-25uM，更优选为100nM、300nM、500nM、700nM、900nM、1uM、2.5uM、5uM、7.5uM、10uM、12.5uM、15uM、17.5uM、20uM或22uM。


2.培养基，其特征在于，在NouvNeu-basal基础培养基中加入LY2157299，所述NouvNeu-basal基础培养基的配方为杜氏改良伊格尔/F12培养基(DMEM/F12培养基)、0.1％-2％最低必须培养基非必需氨基酸(MinimumEssentialMediumNon-EssentialAminoAcids，最佳浓度为1％)、0.1-0.8g/L氯化钠(SodiumChloride，最佳浓度为0.5g/L)、0.1-80mg/L维生素C(L-ascorbicacid，最佳浓度为64mg/L)、0.1-1.8uM维生素B12(最佳浓度为1.2uM)、0.1-9.8ng/ml黄体酮(Progesterone，最佳浓度6.3ng/ml)、10-35ug/ml腐胺(Putrescine，最佳浓度为23ug/ml)、1ug/L-25ug/L亚硒酸钠(最佳浓度为13.6ug/L)、0.1-44ug/ml胰岛素(最佳浓度为22ug/ml)、0.5-20umol/LOptiferrin(最佳浓度为10μmol/L)、2.5-100ng/ml植物源重组人碱性生长因子(OsrbFGF，最佳浓度为50ng/mL)。


3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述LY2157299的用量为55nM-25uM，优选为100nM、300nM、500nM、700nM、900nM、1uM、2.5uM、5uM、7.5uM、10uM、12.5uM、15uM、17.5uM、20uM或22uM。


4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述LY2157299的用量为7.5uM。


5.将多能干细胞(优选人源多能干细胞)分化为外胚层的方法，其特征在于，将多能干细胞在根据权利要求2-4任一项所述的培养基中培养，获得外胚层细胞。


6.培养基，其特征在于，在NouvNeu-basal基础培养基中加入LY2157299和JW55，所述NouvNeu-basal基础培养基的配方为杜氏改良伊格尔/F12培养基(DMEM/F12培养基)、0.1％-2％最低必须培养基非必需氨基酸(MinimumEssentialMediumNon-EssentialAminoAcids，最佳浓度为1％)、0.1-0.8g/L氯化钠(SodiumChloride，最佳浓度为0.5g/L)、0.1-80mg/L维生素C(L-ascorbicacid，最佳浓度为64mg/L)、0.1-1.8uM维生素B12(最佳浓度为1.2uM)、0.1-9.8ng/ml黄体酮(Progesterone，最佳浓度6.3ng/ml)、10-35ug/ml腐胺(Putrescine，最佳浓度为23ug/ml)、1ug/L-25ug/L亚硒酸钠(最佳浓度为13.6ug/L)、0.1-44ug/ml胰岛素(最佳浓度为22ug/ml)、0.5-20umol/LOptiferrin(最佳浓度为10μmol/L)、2.5-100ng/ml植物源重组人碱性生长因子(OsrbFGF，最佳浓度为50ng/mL)；任选地，所述JW55的浓度为0.5-20uM，最佳浓度为5uM；任选地，所述LY2157299的用量为55nM-25uM，优选为100nM、300nM、500nM、700nM、900nM、1uM、2.5uM、5uM、7.5uM、10uM、12.5uM、15uM、17.5uM、20uM或22uM。


7.将多能干细胞(优选人源多能干细胞)分化为神经干细胞的方法，其特征在于，将多能干细胞在根据权利要求6所述的培养基中培养。


8.AM580在多能干细胞(优选人源多能干细胞)分化为光感受器神经元细胞中的应用，优选地，所述AM580的用量为0.05-0.95μM，更优选为0.08uM，0.09uM，0.1uM，0.2uM，0.3uM，0.5uM，0.6uM，0.7uM，0.8uM，0.9uM。


9.AM580在外胚层细胞分化为光感受器神经元细胞中的应用，优选地，所述AM580的用量为0.05-0.95μM，更优选为0.08uM，0.09uM，0.1uM，0.2uM，0.3uM，0.5uM，0.6u...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏君，蔡萌，牛璐萌，周佳，
申请(专利权)人：武汉睿健医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42