基于体外诱导EPS发育形成类囊胚结构的方法技术

本发明专利技术涉及生命科学技术领域，具体涉及一种基于体外诱导EPS发育形成类囊胚结构的方法，包括如下步骤：A.利用BMP4诱导EPS细胞分化为滋养外胚层样细胞；B.将滋养外胚层样细胞和EPS细胞按比例使用N2B27‑LCDM培养基或/和IVCI培养基的混合培养为类胚囊结构。本发明专利技术的方法可行性强，可重复，可以成功利用人EPS体外诱导培养形成的人工类囊胚结构。

【技术实现步骤摘要】
基于体外诱导EPS发育形成类囊胚结构的方法
本专利技术涉及生命科学
，具体涉及一种基于体外诱导EPS发育形成类囊胚结构的方法。
技术介绍
胚胎发育是人类个体形成过程中的起始环节，人类受精卵的发育始于一系列卵裂和形态发生重排，形成囊胚。晚期囊胚包括三个不同的细胞谱系(epiblast,EPI)和两个胚外组织(primitiveendoderm,PE；trophoectoderm,TE)，在植入子宫后，前者产生三胚层细胞以及整个胎儿，而后两者分别产生卵黄膜和胎盘。对于囊胚前期人胚胎的发育，已经开展了广泛的研究，取得了重要的进展(可参见：YanL,YangM,GuoH,YangL,WuJ,LiR,LiuP,LianY,ZhengX,YanJetal:Single-cellRNA-Seqprofilingofhumanpreimplantationembryosandembryonicstemcells.Naturestructural&molecularbiology2013,20(9):1131-1139.；DeglincertiA,CroftGF,PietilaLN,Zernicka-GoetzM,SiggiaED,BrivanlouAH:Self-organizationoftheinvitroattachedhumanembryo.Nature2016,533(7602):251-254.)。然而在发育到第7天，人胚胎需要植入母亲的子宫内膜中才能继续发育。这个阶段的胚胎在子宫内发生的变化以及导致这些变化的关键细胞和分子事件，由于材料的无法获得以及缺乏相应的体外研究体系导致这些问题仍不清楚(可参见：NakamuraT,OkamotoI,SasakiK,YabutaY,IwataniC,TsuchiyaH,SeitaY,NakamuraS,YamamotoT,SaitouM:Adevelopmentalcoordinateofpluripotencyamongmice,monkeysandhumans.Nature2016,537(7618):57-62.；RossantJ,TamPPL:NewInsightsintoEarlyHumanDevelopment:LessonsforStemCellDerivationandDifferentiation.Cellstemcell2017,20(1):18-28.)。着床后人胚胎发育是生命发生的重要研究领域，胚胎无法植入以及在此阶段的发育异常是导致早期妊娠流产的主要原因(可参见：RossantJ:Humanembryology:Implantationbarrierovercome.Nature2016,533(7602):182-183.)。着床后胚胎发育关键事件的解析对组织器官再生研究和早期胚胎发育疾病的预防与治疗具有重要的科学意义(可参见：BedzhovI,Zernicka-GoetzM:Self-organizingpropertiesofmousepluripotentcellsinitiatemorphogenesisuponimplantation.Cell2014,156(5):1032-1044.)。由于取材及伦理的限制，人胚胎着床后的发育研究几乎不可能开展，该领域的进一步发展亟待创新的技术突破。2016年英国剑桥大学和美国洛克菲勒大学科学家MagdalenaZernicka-Goetz和AliH.Brivanlou共同建立胚胎体外延迟培养技术，突破了着床后胚胎发育的研究瓶颈，他们在2维(2D)培养皿中成功将人囊胚(E5-E6)延迟培养到12-13天(可参见：ShahbaziMN,JedrusikA,VuoristoS,RecherG,HupalowskaA,BoltonV,FogartyNNM,CampbellA,DevitoL,IlicDetal:Self-organizationofthehumanembryointheabsenceofmaternaltissues.Naturecellbiology2016,18(6):700-708.；DeglincertiA,CroftGF,PietilaLN,Zernicka-GoetzM,SiggiaED,BrivanlouAH:Self-organizationoftheinvitroattachedhumanembryo.Nature2016,533(7602):251-254.)。这些2D培养的胚胎初步显示出体内胚胎发育的一些简单结构，扩展了对人类早期胚胎发育的认识，Science杂志将其评为2016年全球十大科技进展之首。2019年北京大学汤富酬教授和北京大学第三医院的乔杰教授团队运用这一技术，结合单细胞多组学技术，揭示了人类早期胚胎着床后发育的基因表达调控网络和DNA甲基化动态变化规律(可参见：ZhouF,WangR,YuanP,RenY,MaoY,LiR,LianY,LiJ,WenL,YanLetal:ReconstitutingthetranscriptomeandDNAmethylomelandscapesofhumanimplantation.Nature2019,572(7771):660-664.)。然而在培养皿中进行2D培养的胚胎存在一些重要的缺陷，比如二维培养的胚胎是扁平的，与体内3D胚胎有明显的差异；2D培养的胚胎其细胞之间的拓扑关系和连接与体内胚胎存在明显的差异；虽然2D培养的胚胎的滋养外胚层12天后仍在继续存活，但是整个胚胎结构发生了坍塌和出现了发育的紊乱，导致很多细胞类型(羊毛上皮)、腔(羊膜腔、卵黄囊腔)和结构(基底膜、前后轴、原条)无法在2D培养的胚胎中清楚地观测到(可参见：MartynI,KannoTY,RuzoA,SiggiaED,BrivanlouAH:Self-organizationofahumanorganizerbycombinedWntandNodalsignalling.Nature2018,558(7708):132-135.)。因此，这些缺陷使得该体系很难真正模拟体内胚胎的发育。2020年昆明理工大学季维智教授和李天晴教授团队首次建立人胚胎三维培养系统，绘制了人原肠胚前期胚胎的发育全景图，这些3D培养条件下的胚胎能高度地模仿体内胚胎的发育，经历不同形态的发育并自发组装成2D条件下无法产生的3D结构，包括胚胎双层胚盘、羊膜(amnion)、基底膜(basalmembrane)、初级和灵长类独特的次级卵黄膜囊、前后轴以及原条(可参见：XiangL,YinY,ZhengY,MaY,LiY,ZhaoZ,GuoJ,AiZ,NiuY,DuanKetal:Adevelopmentallandscapeof3D-culturedhumanpre-gastrulationembryos.Nature2020,577(7791):537-542.)。这项研究成果成为人着床后的早期胚胎发育建立了重要的研究基础。由于人胚胎体外培养不能超过14天规则的限制，上述工作停止于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于体外诱导EPS发育形成类囊胚结构的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nA.利用BMP4诱导EPS细胞分化为滋养外胚层样细胞；/nB.将滋养外胚层样细胞和EPS细胞按比例使用N2B27-LCDM培养基和IVCI培养基的混合培养基培养为类胚囊结构。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于体外诱导EPS发育形成类囊胚结构的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A.利用BMP4诱导EPS细胞分化为滋养外胚层样细胞；
B.将滋养外胚层样细胞和EPS细胞按比例使用N2B27-LCDM培养基和IVCI培养基的混合培养基培养为类胚囊结构。


2.根据权利要求1所述基于体外诱导EPS发育形成类囊胚结构的方法，其特征在于，步骤A中，所述滋养外胚层样细胞的分化过程如下：
1)将EPS细胞使用BMP4诱导培养，经清洗、破膜、封闭处理后，置于分化一抗中过夜孵育；
2)次日清洗后，置于分化二抗中室温孵育，孵育完成后，清洗；
3)清洗完成后的干细胞置于CK7直染抗体和DAPI混合溶液中室温孵育，清洗。


3.根据权利要求2所述基于体外诱导EPS发育形成类囊胚结构的方法，其特征在于，步骤1)中，将EPS细胞使用25ng/ml的BMP4诱导培养基培养3-5天，每天更换培养基。


4.根据权利要求2所述基于体外诱导EPS发育形成类囊胚结构的方法，其特征在于，步骤1)中，所述清洗、破膜、封闭处理的过程如下：将培养完成的细胞用PBS清洗后，加入4％甲醛，室温固定30分钟，PBS清洗后加入0.3％Triton-x100，室温条件下破膜1小时；PBS清洗后加入2％BSA，室温封闭30分钟。


5.根据权利要求2所述基于体外诱导EPS发育形成类囊胚结构的方法，其特征在于，所述分化一抗为：OCT4和GATA3一抗；
所述分化二抗为：anti-mous...

【专利技术属性】
技术研发人员：于洋，范勇，谭韬，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第三医院广州重症孕产妇救治中心，广州柔济医院，
类型：发明
国别省市：广东;44