一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法技术

本发明专利技术属于分离培养原代干细胞技术领域，公开了一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法，无菌条件下，取孕中期绵羊胎儿，剪切相应组织于培养液II中静置；采用组织机械分离方法分离，用培养液I于37℃5％CO

【技术实现步骤摘要】
一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法
本专利技术属于分离培养原代干细胞
，尤其涉及一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法。
技术介绍
目前，动物是干细胞的重要来源和研究素材。从动物机体组织中分离培养原代干细胞首先面临的就是来自于组织和操作过程中所带来的细菌或真菌污染常常导致原代干细胞分离培养失败，带来的损失有时无法估量，尤其是珍稀野生动物或高价值动物原代干细胞，损失更大。通常，大家在初次从组织中分离原代干细胞时在PBS和培养基中加入1％的双抗来达到除菌的目的。但在实际中，这样做远远不够，经常导致培养的干细胞发生污染而导致原代干细胞分离培养失败。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中从动物机体组织中分离培养原代干细胞，经常导致培养的干细胞发生污染而导致原代干细胞分离培养失败。解决以上问题及缺陷的难度为：在保证所分离培养的动物干细胞不发生分化的前提下不发生污染。解决以上问题及缺陷的意义为：能够确保所分离培养的干细胞不发生分化情况下并确保不发生细菌性污染。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法。本专利技术是这样实现的，一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法，所述动物原代干细胞除菌培养液的制备方法，包括：步骤一，无菌条件下，取孕中期绵羊胎儿，剪切相应组织于培养液II中静置30min；步骤二，采用组织机械分离方法分离，用培养液I于37℃5％CO2饱和湿度条件下培养绵羊胎儿组织原代细胞48h～96h；步骤三，细胞克隆出现后用D-PBS洗3遍，挑取状态较好的细胞克隆用培养液III培养，培养至3～4代冻存备用。进一步，所述培养基液I：1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、微量β-巯基乙醇、5ng或500u/mLLIF、5ng/mLbFGF、15％FBS、青霉素200U、链霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素15μg、两性霉素B5μg，DMEM(低糖)定容至100mL，用0.22μL的滤器过滤，4℃保存。进一步，所述培养液II：青霉素200U、链霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素、15μg两性霉素B5μg，D-PBS定容至100mL，4℃保存。进一步，所述培养液III：1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、微量β-巯基乙醇、5ng或500u/mLLIF、5ng/mLbFGF+15％FBS，DMEM(低糖)定容至100mL，用0.22μL的滤器过滤，4℃保存。本专利技术满足动物干细胞的生长营养需求，保证动物干细胞培养过程中不发生细菌性污染。结合上述的所有技术方案，本专利技术所具备的优点及积极效果为：本专利技术所配置的培养液能100％确保在96h内分离培养动物原代干细胞时无细菌性污染发生。同时本专利技术所采用的培养液能够保证分离的动物原代细胞保持干细胞特性。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例提供的动物原代干细胞除菌培养液的制备方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的绵羊胎儿肺脏组织原代干细胞(悬浮)示意图。图3是本专利技术实施例提供的绵羊胎儿肺脏组织原代干细胞(贴壁)示意图。图4是本专利技术实施例提供的干细胞标志端粒酶检测阳性示意图。图5是本专利技术实施例提供的干细胞标志Oct-4抗原检测阳性示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法，下面结合附图对本专利技术作详细的描述。如图1所示，本专利技术实施例提供的动物原代干细胞除菌培养液的制备方法，包括：S101：无菌条件下，取孕中期绵羊胎儿，剪切相应组织于培养液II中静置30min；S102：采用组织机械分离方法分离，用培养液I于37℃5％CO2饱和湿度条件下培养绵羊胎儿组织原代细胞48h～96h；S103：细胞克隆出现后用D-PBS洗3遍，挑取状态较好的细胞克隆用培养液III培养，培养至3～4代冻存备用。本专利技术实施例提供的培养基液I：1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、微量β-巯基乙醇、5ng或500u/mLLIF、5ng/mLbFGF、15％FBS、青霉素200U、链霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素15μg、两性霉素B5μg，DMEM(低糖)定容至100mL，用0.22μL的滤器过滤，4℃保存。本专利技术实施例提供的培养液II：青霉素200U、链霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素、15μg两性霉素B5μg，D-PBS定容至100mL，4℃保存。本专利技术实施例提供的培养液III：1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、微量β-巯基乙醇、5ng或500u/mLLIF、5ng/mLbFGF+15％FBS，DMEM(低糖)定容至100mL，用0.22μL的滤器过滤，4℃保存。下面结合具体实验对本专利技术的技术方案作进一步的描述。培养基液I：1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、微量β-巯基乙醇、5ng或500u/mLLIF、5ng/mLbFGF、15％FBS、青霉素200U、链霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素15μg、两性霉素B5μg，DMEM(低糖)定容至100mL，用0.22μL的滤器过滤，4℃保存。培养液II：青霉素200U、链霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素、15μg两性霉素B5μg，D-PBS定容至100mL，4℃保存。培养液III：1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、微量β-巯基乙醇、5ng或500u/mLLIF、5ng/mLbFGF+15％FBS，DMEM(低糖)定容至100mL，用0.22μL的滤器过滤，4℃保存。绵羊胎儿组织中干细胞的原代培养的新方法：无菌条件下，取孕中期绵羊胎儿，剪切相应组织于培养液II中静置30min，采用组织机械分离方法分离，用培养液I于37℃5％CO2饱和湿度条件下培养绵羊胎儿组织原代细胞48h～96h；细胞克隆出现后用D-PBS洗3遍，挑取状态较好的细胞克隆用培养液III培养，培养至3～4代冻存备用。结果：所获得的绵羊羊水干细胞及胎儿组织干细胞在分离培养的48-96h内，均无细菌性污染现象发生，能够100％保证分离培养的成功。并且所分离的干细胞特性标志阳性。下面的结合实验对本专利技术的技术效果作详细的描述。一、绵羊胎儿组织中干细胞的原代培养的新方法：无菌条件下，取孕中期绵羊胎儿，剪切本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法，其特征在于，所述动物原代干细胞除菌培养液的制备方法，包括：/n无菌条件下，取孕中期绵羊胎儿，剪切相应组织于培养液II中静置30min；/n采用组织机械分离方法分离，用培养液I于CO

【技术特征摘要】
1.一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法，其特征在于，所述动物原代干细胞除菌培养液的制备方法，包括：
无菌条件下，取孕中期绵羊胎儿，剪切相应组织于培养液II中静置30min；
采用组织机械分离方法分离，用培养液I于CO2饱和湿度条件下培养绵羊胎儿组织原代细胞；
细胞克隆出现后用D-PBS洗，挑取状态较好的细胞克隆用培养液III培养，培养冻存备用。


2.如权利要求1所述动物原代干细胞除菌培养液的制备方法，其特征在于，所述培养基液I：1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、微量β-巯基乙醇、5n954g或500u/mLLIF、5ng/mLbFGF、15％FBS、青霉素200U、链霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素15μg、两性霉素B5μg，DMEM低糖定容至100mL，用0.22μL的滤器过滤，4℃保存。


3.如权利要求1所述动物原代干细胞除菌培养液的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凤武，李军燕，李晓奇，罗晓平，张琼琳，孙杰，闫红霞，侯勇跃，
申请(专利权)人：内蒙古自治区农牧业科学院，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15